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प्राइमर एनीलिंग पर एकल न्यूक्लियोटाइड विलोपन या सम्मिलन का प्रभाव

प्राइमर एनीलिंग पर एकल न्यूक्लियोटाइड विलोपन या सम्मिलन का प्रभाव


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प्राइमर एनीलिंग कैसे है, और इसके परिणामस्वरूप, पीसीआर प्रवर्धन एकल न्यूक्लियोटाइड विलोपन या प्राइमर के अंदर सम्मिलन से प्रभावित?

इस तरह एक प्राइमर की कल्पना करो:
GCGTCATAAAGGGGACGTG (प्राइमर)
और टेम्प्लेट डीएनए के संबंधित भाग में एक G गायब है, इसलिए यह इस तरह दिखता है:
GCGTCATAAAGGGACGTG (टेम्पलेट)।

संभावित जोड़ी हो सकती है
GCGTCATAAAGGGGACGTG प्राइमर
GCGTCATAAA_GGGACGTG टेम्प्लेट
या
GCGTCATAAAGGGGACGTG प्राइमर
GCGTCATAAAGGG_ACGTG टेम्प्लेट
या बीच में कुछ भी।

क्या यह संभव है कि ऐसे प्राइमर के साथ प्रवर्धन 60 डिग्री सेल्सियस एनीलिंग पर सामान्य वास्तविक समय पीसीआर में पूरी तरह से बाधित हो जाए? क्या यह पूरी तरह से प्रवर्धन को बाधित कर सकता है?

अगर बेमेल था प्रतिस्थापन-जैसे, मुझे पूरा भरोसा होगा, प्राइमर अभी भी कार्यात्मक होगा और प्रवर्धन होगा। चरम मामले में, यह देर से सीटी पर कम से कम अवशिष्ट प्रवर्धन होगा। बहुत सारे डेटा हैं, कैसे प्रतिस्थापन बेमेल प्राइमरों को प्रभावित करते हैं और मुझे इसके साथ बहुत से व्यक्तिगत अनुभव भी हैं।

दुर्भाग्य से विलोपन बेमेल कम अध्ययन के साथ-साथ googleproof हैं। मुझे मिला एकमात्र संकेत यह काम है:
लिप्स्की आरएच, माज़ांती सीएम, रूडोल्फ जेजी, जू के, व्यास जी, बोज़ाक डी, एट अल। एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं का पता लगाने के लिए डीएनए पिघलने का विश्लेषण। क्लिन केम। 2001;47:635-44।
उस कार्य में, एकल न्यूक्लियोटाइड विलोपन का प्रतिस्थापन बेमेल की तुलना में पिघलने के तापमान पर समान या कम प्रभाव पड़ा। लेकिन यह लंबे समय तक ओलिगो के बारे में था। उदाहरण:
हटाने का प्रभाव:
133 बीपी टुकड़ा, 67% जीसी, स्थिति 43 पर हटाने एसएनपी, डेल्टा टीएम (होमो-हेटेरो डुप्लेक्स) = 1.2 डिग्री सेल्सियस
प्रतिस्थापन के प्रभाव:
152 बीपी टुकड़ा, 43% जीसी, प्रतिस्थापन टी से सी स्थिति 68 पर, डेल्टा टीएम (होमो-हेटेरो डुप्लेक्स) = 0.9 डिग्री सेल्सियस
100 बीपी टुकड़ा, 41% जीसी, प्रतिस्थापन टी से सी 42 की स्थिति में, डेल्टा टीएम (होमो-हेटेरो डुप्लेक्स) = 1.4 डिग्री सेल्सियस
163 बीपी टुकड़ा, 60% जीसी, 86 की स्थिति में सी से टी का प्रतिस्थापन, डेल्टा टीएम (होमो-हेटेरो डुप्लेक्स) = 2.2 डिग्री सेल्सियस
110 बीपी टुकड़ा, 59% जीसी, स्थान 66, डेल्टा टीएम (होमो-हेटेरो डुप्लेक्स) = 3.8 डिग्री सेल्सियस पर ए के लिए प्रतिस्थापन जी

प्रशन:
1. क्या आप मुझे साहित्य की सिफारिश कर सकते हैं कि कैसे विलोपन बेमेल अंदर (बहुत अंत में नहीं !!!) प्राइमर एनीलिंग और पीसीआर को प्रभावित करते हैं?
2. क्या आप अनुमान लगा सकते हैं कि मेरे उदाहरण में प्राइमर अभी भी कार्यात्मक होगा, कम से कम आंशिक रूप से, या आप बिल्कुल भी प्रवर्धन की उम्मीद नहीं करेंगे?


आपके इनपुट के बाद संपादित करें:
यह ऑनलाइन आवेदन "mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/टू-स्टेट-मेल्टिंग" सोचता है, विलोपन बेमेल प्रतिस्थापन की तुलना में अधिक अस्थिर करने वाले हैं, कम से कम छोटे प्राइमरों के लिए। मेरे अपने उदाहरण के लिए, इसने डेल्टा टीएम (होमो-हेटेरो डुप्लेक्स) = 12.9 डिग्री सेल्सियस की गणना की। अगर मैं इसके बजाय प्रतिस्थापन बेमेल का प्रयास करता हूं, तो डेल्टा टीएम (होमो-हेटेरो डुप्लेक्स) अंतराल 3,8 डिग्री सेल्सियस से 5,7 डिग्री सेल्सियस में है।

नया प्रश्न
यदि आपके पास मेरे मामले के समान अनुभव है, जो कि 19 एनटी लंबा प्राइमर है, जो पूरक टेम्पलेट में सिंगल न्यूक्लियोटाइड विलोपन के साथ 3' प्राइमर एंड से सीसीए 6 - 9 की स्थिति में है, 60 डिग्री सेल्सियस पर इस्तेमाल किया जाने वाला तापमान, कृपया मुझे बताएं यदि आपने प्रवर्धन प्राप्त किया है या नहीं। कृपया, मुझे एक संबंधित संदर्भ दें, यदि आपके पास है, तो मैं इसे अपनी समीक्षा में उद्धृत करूंगा :-)।

इसके अलावा, मुझे अभी भी सामान्य जानकारी में दिलचस्पी है, जब तक कि विषय एकल न्यूक्लियोटाइड विलोपन या प्राइमरों में सम्मिलन के बारे में पर्याप्त संकीर्ण हो। (प्रतिस्थापन बेमेल नहीं)।


हमने इस प्रकार के प्राइमरों का उपयोग फ्रेम म्यूटेशन से उत्पन्न करने या अतिरिक्त आधार जोड़ने के लिए किया। मेरे अनुभव में आपका पीसीआर काम करेगा (शायद कम दक्षता) और आपको एक अतिरिक्त आधार वाला उत्पाद मिलेगा। हमने प्लास्मिड के पीसीआर आधारित साइट निर्देशित उत्परिवर्तजन में बड़े अंतर वाले प्राइमरों का उपयोग किया, वहां 10 बेस तक मेल नहीं खाते थे, लेकिन प्राइमर जहां भी लंबे थे। एकल न्यूक्लियोटाइड बेमेल (या तो + या - एक आधार) के लिए हमने इस आकार के आसपास प्राइमरों का उपयोग किया।

साहित्य के संबंध में, यह प्रकाशन उपयोगी हो सकता है:

विशेष रूप से पहले प्रकाशन में कई अन्य रोचक संदर्भ शामिल हैं।


एक और संदर्भ जोड़ना। यह समूह विभिन्न बेमेल (जैसे ए> टी बनाम ए> जी) के प्रभाव को देखता है और स्थितिगत प्रभावों को भी देखता है।

हमारे परिणाम बताते हैं कि एकल बेमेल प्रभाव की एक विस्तृत विविधता को उकसाता है, जिसमें मामूली (<1.5 चक्र सीमा, जैसे, एसी, सीए, टीजी, जीटी) से लेकर गंभीर प्रभाव (> 7.0 चक्र सीमा, जैसे, एए, जीए, एजी, सीसी) शामिल हैं। ) पीसीआर प्रवर्धन पर। विशिष्ट बेमेल प्रकार, स्थिति और प्रभाव के बीच एक स्पष्ट संबंध पाया गया।

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2797725/


एक कुशल एक-चरण साइट-निर्देशित विलोपन, सम्मिलन, एकल और एकाधिक-साइट प्लास्मिड उत्परिवर्तजन प्रोटोकॉल

Mutagenesis आणविक जीव विज्ञान और जैव रसायन में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। इसका उपयोग एंजाइमोलॉजी और प्रोटीन विज्ञान में प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए भी किया गया है जो बायोफिजिकल तकनीकों के लिए अधिक ट्रैक्टेबल हैं। प्रोटीन में अवशेषों को जल्दी और विशेष रूप से उत्परिवर्तित करने की क्षमता यंत्रवत और कार्यात्मक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि कई साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन विधियों को विकसित किया गया है, एक सरल, त्वरित और बहु-लागू विधि अभी भी वांछनीय है।

परिणाम

हमने साइट-निर्देशित प्लास्मिड उत्परिवर्तजन प्रोटोकॉल विकसित किया है जिसने क्विकचेंज™ साइट-निर्देशित उत्परिवर्तजन की सरल एक चरण प्रक्रिया को संरक्षित किया है लेकिन इसकी दक्षता को बढ़ाया है और बहु-साइट उत्परिवर्तजन के लिए इसकी क्षमता को बढ़ाया है। इस संशोधित प्रोटोकॉल ने एक नए प्राइमर डिज़ाइन का उपयोग किया जिसने प्राइमर डिमराइज़ेशन को समाप्त करके प्राइमर-टेम्पलेट एनीलिंग को बढ़ावा दिया और नए संश्लेषित डीएनए को बाद के प्रवर्धन चक्रों में टेम्पलेट के रूप में उपयोग करने की अनुमति दी। इन दो कारकों को हम मानते हैं कि बढ़ी हुई प्रवर्धन दक्षता और बहु-साइट उत्परिवर्तन में इसके अनुप्रयोगों के मुख्य कारण हैं।

निष्कर्ष

हमारे संशोधित प्रोटोकॉल ने एकल उत्परिवर्तन की दक्षता में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि की और एक एकल प्रयोग में बड़े एकल सम्मिलन, विलोपन/छंटनी और एकाधिक उत्परिवर्तन की अनुमति दी, एक विकल्प जो मानक QuikChange™ के साथ असंगत है। इसके अलावा नए प्रोटोकॉल में काफी कम माता-पिता के डीएनए की आवश्यकता होती है जो कि सुविधा प्रदान करता है डीपीएनमैंने पीसीआर प्रवर्धन के बाद पाचन किया और समग्र दक्षता और विश्वसनीयता को बढ़ाया। अपने प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने सिंगल साइट, मल्टीपल सिंगल-साइट म्यूटेशन और एक संयुक्त इंसर्शन/डिलीशन म्यूटेशन जेनरेट किया। परिणामों ने प्रदर्शित किया कि इस नए प्रोटोकॉल ने कोई अतिरिक्त अभिकर्मक लागत नहीं लगाई (बुनियादी क्विकचेंज ™ से परे) लेकिन समग्र सफलता दर में वृद्धि हुई।


सार

छोटे न्यूक्लियोटाइड सम्मिलन/विलोपन (इंडेल) त्रुटियां डीएनए संश्लेषण में सामान्य प्रतिकृति त्रुटियों में से एक हैं। इंडेल त्रुटि की सबसे लगातार घटना को डीएनए प्रतिकृति के दौरान बार-बार अनुक्रमों के फिसलन होने की संभावना के कारण माना जाता था। आनुवंशिक सूचना लेनदेन की उच्च निष्ठा बनाए रखने के लिए त्रुटि सुधार में प्रूफरीडिंग और डीएनए बेमेल मरम्मत महत्वपूर्ण कारक हैं। हमने इंडेल त्रुटियों के क्लेनो पोलीमरेज़ (KF) प्रूफरीडिंग की दक्षता को मापने के लिए एक MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) विश्लेषण को नियोजित किया। यहां, एक गैर-लेबल और गैर-रेडियो-आइसोटोपिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर को एक एकल न्यूक्लियोटाइड इंडेल त्रुटि बनाने वाले टेम्पलेट डीएनए से जोड़ा जाता है और केएफ द्वारा विभिन्न डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट और/या डिडॉक्सिराइबोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट के संयोजन की उपस्थिति में प्रूफरीड किया गया था। प्रूफरीडिंग उत्पादों की पहचान प्राइमर के KF संशोधित बड़े पैमाने पर परिवर्तन द्वारा की गई थी। हमने प्राइमर-टेम्पलेट जंक्शन के विभिन्न पदों पर इंडेल त्रुटियों वाले डीएनए के प्रूफरीडिंग की जांच की। हमने पाया कि प्राइमर टर्मिनस से 1-5-न्यूक्लियोटाइड्स (एनटी) स्थित इंडेल त्रुटियों को कुशलता से प्रूफरीड किया जा सकता है, जबकि 3 'अंत से 6-एनटी पर सम्मिलन/विलोपन आंशिक रूप से सही और विस्तारित किया जाता है। प्राइमर टर्मिनस से 7-9-एनटी पर स्थित इंडल्स प्रूफरीडिंग से बचते हैं और पोलीमरेज़ द्वारा लंबे होते हैं। इन अवलोकनों के संभावित अंतर्निहित तंत्र की चर्चा संरचना विश्लेषण के माध्यम से पोलीमरेज़ और प्राइमर-टेम्पलेट जंक्शन इंटरैक्शन के संदर्भ में की जाती है।


एक कुशल एक-चरण साइट-निर्देशित विलोपन, सम्मिलन, एकल और एकाधिक-साइट प्लास्मिड उत्परिवर्तजन प्रोटोकॉल

पृष्ठभूमि: उत्परिवर्तन आणविक जीव विज्ञान और जैव रसायन में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। इसका उपयोग एंजाइमोलॉजी और प्रोटीन विज्ञान में भी प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए किया गया है जो बायोफिजिकल तकनीकों के लिए अधिक ट्रैक्टेबल हैं। मशीनी और कार्यात्मक अध्ययनों के लिए प्रोटीन में अवशेषों को जल्दी और विशेष रूप से उत्परिवर्तित करने की क्षमता महत्वपूर्ण है। हालांकि कई साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन विधियों को विकसित किया गया है, एक सरल, त्वरित और बहु-लागू विधि अभी भी वांछनीय है।

परिणाम: हमने साइट-निर्देशित प्लास्मिड उत्परिवर्तजन प्रोटोकॉल विकसित किया है जिसने क्विकचेंज साइट-निर्देशित उत्परिवर्तजन की सरल एक कदम प्रक्रिया को संरक्षित किया है लेकिन इसकी दक्षता को बढ़ाया है और बहु-साइट उत्परिवर्तन के लिए इसकी क्षमता को बढ़ाया है। इस संशोधित प्रोटोकॉल ने एक नए प्राइमर डिज़ाइन का उपयोग किया जिसने प्राइमर डिमराइज़ेशन को समाप्त करके प्राइमर-टेम्पलेट एनीलिंग को बढ़ावा दिया और नए संश्लेषित डीएनए को बाद के प्रवर्धन चक्रों में टेम्पलेट के रूप में उपयोग करने की अनुमति दी। इन दो कारकों को हम मानते हैं कि बढ़ी हुई प्रवर्धन दक्षता और बहु-साइट उत्परिवर्तन में इसके अनुप्रयोगों के मुख्य कारण हैं।

निष्कर्ष: हमारे संशोधित प्रोटोकॉल ने एकल उत्परिवर्तन की दक्षता में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि की और एक एकल प्रयोग में बड़े एकल सम्मिलन, विलोपन/छंटनी और एकाधिक उत्परिवर्तन की भी अनुमति दी, एक विकल्प जो मानक QuikChange के साथ असंगत है। इसके अलावा नए प्रोटोकॉल में काफी कम पैतृक डीएनए की आवश्यकता थी जिसने पीसीआर प्रवर्धन के बाद डीपीएनआई पाचन की सुविधा प्रदान की और समग्र दक्षता और विश्वसनीयता को बढ़ाया। अपने प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने सिंगल साइट, मल्टीपल सिंगल-साइट म्यूटेशन और एक संयुक्त इंसर्शन/डिलीशन म्यूटेशन जेनरेट किया। परिणामों ने प्रदर्शित किया कि इस नए प्रोटोकॉल ने कोई अतिरिक्त अभिकर्मक लागत (बुनियादी क्विकचेंज से परे) नहीं लगाई, लेकिन समग्र सफलता दर में वृद्धि की।


परिणाम

परख विकास

हमने एलील भेदभाव के लिए उनकी क्षमता का आकलन करने के लिए डिडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड निगमन के लिए डिज़ाइन किए गए दो थर्मोस्टेबल पोलीमरेज़ का मूल्यांकन किया: थर्मो सीक्वेनेस (थर्मस एक्वाटिकस डीएनए पोलीमरेज़ F667Y) और थर्मिनेटर (थर्मोकोकस 9°N-7 डीएनए पोलीमरेज़ A485L)। चित्रा 2 टर्मिनेटर एकाग्रता के एक समारोह के रूप में जी/ए एसएनपी की एक श्रृंखला में इन एंजाइमों द्वारा विशिष्ट टर्मिनेटर निगमन प्रस्तुत करता है। पीसीआर और जीनोमिक डीएनए टेम्प्लेट की सफाई को विधियों के तहत वर्णित किया गया था, आपूर्ति किए गए बफ़र्स और 10 मिमी ddNTP टर्मिनेटर की उपस्थिति में विस्तार के साथ। हमने पूरक और गैर-पूरक (गलत) टर्मिनेटरों के निगमन संकेतों के बीच अंतर के रूप में विशिष्ट निगमन का आकलन किया। उच्च एंजाइम सांद्रता पर, गैर-विशिष्ट निगमन देखा जा सकता है। इन प्रारंभिक परीक्षणों के साथ, थर्मिनेटर के लिए 0.004 इकाइयों/μl और थर्मो सीक्वेनेस के लिए 0.02 इकाइयों/μl के विस्तार एंजाइम सांद्रता में सबसे बड़ा विशिष्ट निगमन देखा गया था।

विस्तार पोलीमरेज़ एकाग्रता वक्र। () थर्मिनेटर एकाग्रता के एक समारोह के रूप में विशिष्ट निगमन। (बी) थर्मो सीक्वेनेस एकाग्रता के एक समारोह के रूप में विशिष्ट निगमन।

विस्तार पोलीमरेज़ एकाग्रता वक्र। () थर्मिनेटर एकाग्रता के एक समारोह के रूप में विशिष्ट निगमन। (बी) थर्मो सीक्वेनेस एकाग्रता के एक समारोह के रूप में विशिष्ट निगमन।

थर्मो सीक्वेनेस और थर्मिनेटर दोनों ने अलग-अलग एसएनपी (जैसे अनुपूरक चित्र। एस 2) में अपेक्षित परख प्रदर्शन भिन्नता दिखाई। अनुकूलन को परखने में सहायता के रूप में, हमने टेम्पलेट और भिन्न साइट संदर्भ पर नियंत्रण प्रदान करने के लिए एक सिंथेटिक लक्ष्य प्रणाली तैयार की। इन लक्ष्यों में फ़्लैंकिंग पीसीआर प्राइमिंग साइट अनुक्रमों के साथ-साथ एक विस्तार प्राइमर के बाद के संकरण के लिए एक भिन्न स्थिति के आसपास पर्याप्त अनुक्रम शामिल हैं, जिससे भिन्न स्थिति में टर्मिनेटर निगमन की सुविधा मिलती है। सिंथेटिक लक्ष्य टेम्पलेट परख प्रदर्शन के उदाहरण चित्र 3 में दिखाए गए हैं।

थर्मिनेटर का उपयोग करके इंजीनियर एसएनपी के रूप में सिंथेटिक लक्ष्य टेम्पलेट (SynFP_C और SynFP_T) का उदाहरण परख () या थर्मो सीक्वेनेस (बी).

थर्मिनेटर का उपयोग करके इंजीनियर एसएनपी के रूप में सिंथेटिक लक्ष्य टेम्पलेट (SynFP_C और SynFP_T) का उदाहरण परख () या थर्मो सीक्वेनेस (बी).

हमने थर्मिनेटर द्वारा टर्मिनेटर निगमन पर विस्तार बफर संरचना के प्रभाव की जांच की। हमने सिंथेटिक लक्ष्य SynFP_C और SynFP_T (ddG-R110 और ddA-TAMRA को शामिल करते हुए) और 2 mM, 10 mM KCl, 10 mM (NH) के प्रारंभिक बफर को नियोजित किया।4)2इसलिए4, 0.1% ट्राइटन एक्स-100, और 20 मिमी ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.8। हमारा दृष्टिकोण एक घटक की सांद्रता की एक श्रृंखला का परीक्षण करना था, प्रत्येक दूसरे घटक की सांद्रता की एक श्रृंखला की उपस्थिति में, जबकि अन्य चर स्थिर रखते हुए। हमने शुरुआती बफर में बदलाव के रूप में नई स्थिति को अपनाते हुए, दो परीक्षण किए गए घटकों में से प्रत्येक के लिए इष्टतम का चयन किया। हमने इस दृष्टिकोण का पालन तब तक किया जब तक कि प्रत्येक चर के लिए ऑप्टिमा का चयन नहीं किया गया। अनुकूलित प्रतिक्रिया 0.5 μM एक्सटेंशन प्राइमर और 1 × बफर A: 2 mM MgSO . थी4, 5 मिमी (एनएच4)2इसलिए4, और 0.1% ट्राइटन एक्स-100, और 20 मिमी ट्रिस-एचसीएल पीएच 9.3। थर्मो सीक्वेनेज़ ने भी इन स्थितियों में अच्छा प्रदर्शन किया, हालांकि हमने बाद में इसके लिए समान रूप से बफर बी को अनुकूलित किया (नीचे आगे वर्णित)।

हमने अगली बार ddU-TAMRA, ddG-R110, ddC-R110, और ddA-TAMRA टर्मिनेटर निगमन की दक्षता का मूल्यांकन थर्मिनेटर और थर्मो सीक्वेंस द्वारा बफर ए में चार संबंधित सिंथेटिक लक्ष्यों (छवि 4) का उपयोग करके किया। केवल थर्मो सीक्वेनेस ने इन चारों टर्मिनेटरों को कुशलता से शामिल किया, और इसलिए बाद के सभी प्रयोगों के लिए चुना गया। थर्मो सीक्वेनेस के लिए, इन चार टर्मिनेटरों के इष्टतम 1 × टर्मिनेटर सांद्रता 35 एनएम डीडीए-टीएएमआरए, 4 एनएम डीडीसी-आर 110, 4 एनएम डीडीजी-आर 110, और 10 एनएम डीडीयू-टीएएमआरए (चित्र 5) थे। हमने सिंथेटिक लक्ष्यों और ऊपर उल्लिखित सामान्य दृष्टिकोण (चित्र 6) का उपयोग करके विशेष रूप से थर्मो सीक्वेनेस के लिए एक एक्सटेंशन बफर को और अनुकूलित किया। परिणामी 1 × बफर बी में निहित है: 6 मिमी MgSO4, 5 मिमी (एनएच4)2इसलिए4, 0.05% ट्राइटन X-100, 20 मिमी Tris-HCl pH 8.9, और 5% ग्लिसरॉल का योग। थर्मो सीक्वेनेस एकाग्रता जिस पर टर्मिनेटर निगमन सबसे विशिष्ट था वह 0.0175 यूनिट / μl था। थर्मो सीक्वेनेस (चित्र 7) के लिए 4 एनएम ddU-R110 और 20 एनएम ddC-TAMRA की इष्टतम सांद्रता का चयन करते हुए एक अतिरिक्त दो टर्मिनेटरों का भी मूल्यांकन किया गया था। कुशल और विशिष्ट टर्मिनेटर निगमन के साथ भी, लेबल किए गए एक्सटेंशन प्राइमर का संचय रैखिक थर्मल चक्रों की संख्या का एक कार्य है। एक परख किए गए एसएनपी के दोनों संभावित विस्तार उत्पादों (एफपी योग) के विशिष्ट संकेतों का योग लगभग 26 विस्तार चक्रों (सप्लीमेंट्री अंजीर S3 में सचित्र) पर आधारित है।

थर्मिनेटर और थर्मो सीक्वेनेस द्वारा फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ddNTP टर्मिनेटर निगमन की विशिष्टता, सिंथेटिक लक्ष्य SynFP_A, SynFP_C, SynFP_G, और SynFP_T का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया।

थर्मिनेटर और थर्मो सीक्वेनेस द्वारा फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ddNTP टर्मिनेटर निगमन की विशिष्टता, सिंथेटिक लक्ष्य SynFP_A, SynFP_C, SynFP_G, और SynFP_T का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया।

डीएनडीएनटीपी एकाग्रता के एक समारोह के रूप में थर्मो सीक्वेनेस द्वारा टर्मिनेटर निगमन की विशिष्टता, सिंथेटिक लक्ष्य SynFPz_A, SynFPz_C, SynFPz_G, और SynFPz_T का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया।

डीएनडीएनटीपी एकाग्रता के एक समारोह के रूप में थर्मो सीक्वेनेस द्वारा टर्मिनेटर निगमन की विशिष्टता, सिंथेटिक लक्ष्य SynFPz_A, SynFPz_C, SynFPz_G, और SynFPz_T का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया।

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थर्मो सीक्वेनेस द्वारा बफर घटकों और एंजाइम एकाग्रता के एक समारोह के रूप में टर्मिनेटर निगमन की विशिष्टता। प्रत्येक पैनल एक इष्टतम के चयन के लिए एक मूल्यांकन प्रतिक्रिया घटक वक्र प्रस्तुत करता है।

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थर्मो सीक्वेनेस द्वारा बफर घटकों और एंजाइम एकाग्रता के एक समारोह के रूप में टर्मिनेटर निगमन की विशिष्टता। प्रत्येक पैनल एक इष्टतम के चयन के लिए एक मूल्यांकन प्रतिक्रिया घटक वक्र प्रस्तुत करता है।

ddNTP एकाग्रता के एक समारोह के रूप में थर्मो सीक्वेनेस द्वारा ddC-TAMRA और ddU-R110 निगमन की विशिष्टता, सिंथेटिक लक्ष्य SynFPz_A, SynFPz_C, SynFPz_G, और SynFPz_T का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया।

ddNTP एकाग्रता के एक समारोह के रूप में थर्मो सीक्वेनेस द्वारा ddC-TAMRA और ddU-R110 निगमन की विशिष्टता, सिंथेटिक लक्ष्य SynFPz_A, SynFPz_C, SynFPz_G, और SynFPz_T का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया।

पोस्ट-पीसीआर सफाई (चित्र 8) के लिए एक्सो I या सीआईएपी की घटती एकाग्रता के उपयोग के साथ गलत टर्मिनेटर निगमन समस्याग्रस्त हो जाता है। अवशिष्ट पीसीआर प्राइमर और अवशिष्ट डीएनटीपी एक लेबल टर्मिनेटर को इच्छित, पूछताछ किए गए संस्करण साइट के अलावा किसी अन्य स्थान पर शामिल करने की अनुमति दे सकते हैं। विशिष्ट टर्मिनेटर निगमन के लिए प्रत्येक एंजाइम की इष्टतम सांद्रता प्रति प्रतिक्रिया 0.95 यूनिट थी, जिसमें 30 मिनट के लिए 15 मिनट बनाम 95 डिग्री सेल्सियस के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी निष्क्रियता के बीच कोई अंतर नहीं था।

टर्मिनेटर निगमन विशिष्टता पर CIAP और Exo I एकाग्रता का प्रभाव। सिंथेटिक टेम्पलेट लक्ष्य SynFP_G के लिए विशिष्ट और गैर-विशिष्ट फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ddNTP टर्मिनेटर का समावेश चित्रित किया गया है () और SynFP_A के लिए (बी).

टर्मिनेटर निगमन विशिष्टता पर CIAP और Exo I एकाग्रता का प्रभाव। विशिष्ट और गैर-विशिष्ट फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ddNTP टर्मिनेटरों का समावेश सिंथेटिक टेम्पलेट लक्ष्य SynFP_G के लिए चित्रित किया गया है () और SynFP_A के लिए (बी).

उत्पादन जीनोटाइपिंग के साथ परख प्रदर्शन

हमने 98 एसएनपी और इंडल्स के एक सेट के लिए पुनरावृत्त रूप से अनुकूलित एसएनयूपीई परख को लागू किया, प्रत्येक के लिए जीनोटाइप 2202 डीएनए नमूनों के लिए डिजाइनिंग एसेज़। हमने प्रत्येक के लिए पीसीआर स्थितियों का चयन किया, जिसमें 87 इस्तेमाल किए गए एम्पलीटैक गोल्ड/नो बीटाइन, 9 इस्तेमाल किए गए एम्प्लीटैक गोल्ड/बीटेन, और 2 इस्तेमाल किए गए टाइटेनियम टाक/बीटेन के तहत वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग किया गया है। प्रत्येक वांछित संस्करण परख के लिए, हमने आगे और रिवर्स एक्सटेंशन परख प्रदर्शन की तुलना के लिए एए, एबी (मिश्रित), और बीबी जीनोटाइप का प्रतिनिधित्व करने के लिए डिज़ाइन किए गए सिंथेटिक लक्ष्यों को बढ़ाया। पूरे रक्त से निकाले गए अध्ययन जीनोमिक डीएनए के नमूने के बाद के परीक्षण के लिए सबसे बड़ी एफपी राशि वाले संस्करण का चयन किया गया था। दो 96-वेल प्लेटों की इस स्क्रीन ने 151 विषयों (तीन प्रतियों में 3 मौजूद), 5 नकारात्मक नियंत्रण, और 30 सिंथेटिक लक्ष्य (प्रत्येक होमोज़ायगोट के 10 और मिश्रित/विषमयुग्मजी के 10) का मूल्यांकन किया। उत्तरार्द्ध विशेष रूप से एए, एबी और बीबी क्लस्टर पदों की स्थापना और दुर्लभ एसएनपी के परख प्रदर्शन के लिए सहायक थे (बनाम अज्ञात जीनोटाइप के जीनोमिक डीएनए पर अनिश्चित प्रदर्शन के एक उपन्यास परख का परीक्षण)। 98 डिज़ाइन और परीक्षण किए गए assays में से, 85 ने अध्ययन डीएनए (एक 87% परख रूपांतरण दर) में स्वच्छ जीनोटाइप प्राप्त किए।

हम इन एसएनपी में से 77 और इंडेल एसेज़ (हमारे काम के लिए आवश्यक सबसेट) के साथ उत्पादन जीनोटाइपिंग के लिए 2202 डीएनए नमूनों पर 170 000 कुल जीनोटाइप उत्पन्न करने के लिए आगे बढ़े। हमने दो बेमेल जीनोटाइप कॉल (अनुमानित त्रुटि दर 0.0004) का अवलोकन करते हुए 67 डुप्लिकेट जीनोमिक डीएनए जोड़े को नियंत्रित किया। SNuPE assays से स्वतंत्र, हमने Illumina Infinium MEGA EX array द्वारा समान डीएनए नमूनों को जीनोटाइप किया। ध्यान दें कि विशिष्ट, आवश्यक वेरिएंट के अनुकूलित परख की तुलना में आनुवंशिक वंश के आकलन के लिए एक सरणी सर्वेक्षण अधिक उपयुक्त है। हालांकि हमारे डिजाइन द्वारा नहीं, एसएनयूपीई द्वारा परख किए गए 77 में से 12 वेरिएंट के जीनोटाइप भी सरणी द्वारा उत्पन्न किए गए थे, जिससे ऑर्थोगोनल विधि से जीनोटाइप कॉल की तुलना की जा सकती है। एक गलती से सरणी द्वारा मोनोमोर्फिक था। शेष 11 एसएनपी में 43 विसंगतियों के साथ 17 346 डुप्लिकेट जीनोटाइप मिले, जो 0.003 की विसंगति दर है। ये डेटा अन्य उत्पादन जीनोटाइपिंग दृष्टिकोणों के अनुरूप SNuPE परख के लिए सटीकता का समर्थन करते हैं।

उत्पादन में जीनोटाइप किए गए एसएनयूपीई assays में से छह में परख विकास चरणों में एफपी रकम थी जिसे हमने मान्यता दी थी कि विस्तार प्राइमर टी को बदलकर सुधार किया जा सकता है।एम. उत्पादन जीनोटाइपिंग के दौरान, हमने विस्तार प्राइमर टी . का मूल्यांकन कियाएम विशिष्ट निगमन में सुधार करने की क्षमता के साथ एक अतिरिक्त परख चर के रूप में। हमने उच्च T . का मूल्यांकन और चयन करके छह assays को अनुकूलित किया हैएम एक्सटेंशन प्राइमर (चित्र 9)। कुल मिलाकर, एक्सटेंशन प्राइमर टीएम52.6 डिग्री सेल्सियस से 73.1 डिग्री सेल्सियस के बीच, औसत 58.1 डिग्री सेल्सियस। हम इष्टतम विस्तार प्राइमर टी . का अनुमान लगाते हैंएम डिजाइन लक्ष्य 60 डिग्री सेल्सियस और 65 डिग्री सेल्सियस के बीच होना चाहिए।

विस्तार प्राइमर टी का प्रभावएम एफपी राशि पर प्रत्येक प्रकार के लिए, प्रारंभिक और अनुकूलित T . का FP योगएम एक विस्तारित रेखा के रूप में प्रस्तुत किया गया है।

विस्तार प्राइमर टी का प्रभावएम एफपी राशि पर प्रत्येक प्रकार के लिए, प्रारंभिक और अनुकूलित T . का FP योगएम एक विस्तारित रेखा के रूप में प्रस्तुत किया गया है।

विशिष्ट आवश्यक रूपों का एक महत्वपूर्ण अनुपात आम तौर पर किसी भी वैकल्पिक विधि द्वारा परख के लिए सफलतापूर्वक परिवर्तित करने में विफल रहता है। एक से अधिक दृष्टिकोण अक्सर आवश्यक होते हैं। एक स्वतंत्र उदाहरण के रूप में, 26 एसएनपी के एक सेट के बीच, जिसके लिए हमने पहले तक्मान एसेज़ की मांग की थी, आधे पूर्वनिर्धारित और आधे आवश्यक कस्टम डिज़ाइन उपलब्ध थे। कस्टम सेट में, छह विफल डिज़ाइन, एक डिज़ाइन पास लेकिन वास्तविक परख में विफल रहा, और शेष छह में अच्छा प्रदर्शन था। इस प्रकार, 0.004 की अनुमानित त्रुटि दर (1,139 डुप्लिकेट जीनोटाइप जोड़े के बीच चार जीनोटाइप बेमेल) के साथ, 26 में से 19 (73%) सफलतापूर्वक ताकमान परख के लिए परिवर्तित हो गए।


सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राइमर डिजाइन

कई प्राइमर डिज़ाइन टूल उपलब्ध हैं जो नए और अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए समान रूप से पीसीआर प्राइमर डिज़ाइन में सहायता कर सकते हैं। ये उपकरण असफल प्रयोग की संभावना को कम करके प्रयोग में शामिल लागत और समय को कम कर सकते हैं।

प्राइमर प्रीमियर पीसीआर प्राइमर डिजाइन के लिए निर्दिष्ट सभी दिशानिर्देशों का पालन करता है। प्राइमर प्रीमियर का उपयोग सिंगल टेम्प्लेट, एलाइनमेंट, डिजनरेट प्राइमर डिज़ाइन, प्रतिबंध एंजाइम विश्लेषण के लिए प्राइमरों को डिजाइन करने के लिए किया जा सकता है। अनुक्रम विश्लेषण और अनुक्रमण प्राइमरों का डिज़ाइन।

qPCR प्राइमरी डिज़ाइन के लिए दिशानिर्देश थोड़े भिन्न होते हैं। AlleleID और Beacon Designer जैसे सॉफ़्टवेयर प्रयोग की लागत को कम करने के लिए मल्टीप्लेक्स एसेज़, क्रॉस प्रजाति प्राइमर डिज़ाइन, प्रजाति विशिष्ट प्राइमर डिज़ाइन और प्राइमर डिज़ाइन जैसे जटिल डिटेक्शन एसेज़ के लिए प्राइमर और ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच डिज़ाइन कर सकते हैं।

प्राइमरप्लेक्स एक ऐसा सॉफ्टवेयर है जो मल्टीप्लेक्स पीसीआर और मल्टीप्लेक्स एसएनपी जीनोटाइपिंग एसेज़ के लिए प्राइमर डिजाइन कर सकता है।


तरीके और सामग्री

सी. एलिगेंस मानक विधियों 1 का उपयोग करके उपभेदों को सुसंस्कृत किया गया था। इस अध्ययन को आरंभ करने के लिए प्रयुक्त उपभेद हैं: CB1033 चे-2(e1033), सीबी3329 चे-10(ई1809), आईडब्ल्यू523 चे-10(iw109) daf-3(iw108), सीबी3241 क्लियर-1 (ई1754), सीबी1376 डीएएफ-3(ई1376), VC20208 बिना डीएएफ -3 (जीके 269916), वीसी20379 डीएएफ -3 (आईडब्ल्यू 108), आरबी2589 डीएएफ -3 (ओके 3610), SD378 dpy-17(e164) unc-79(e1068) / mpk-1(ga117), जेएन554 डीआईएफ -11 (पीई554), पीआर813 osm-5(p813), वीसी40961 रंड-1(gk901813), एमटी7554 sqv-3(n2842) unc-69(e587)/qC1, एमटी9647 unc-29(e1072) sqv-5(n3039) / hT2, PR691 टैक्स-2(p691) चे-2(iw107), आरबी1546 टीएमसी-1(ओके1859), वीसी40425 टीएमसी-1(जीके631913), CB4856 हवाईयन HA वाइल्ड आइसोलेट, और N2 वाइल्ड-टाइप स्ट्रेन। इन उपभेदों का उपयोग करके अतिरिक्त उपभेद बनाए गए थे।

वर्मबेस 37 संस्करण WS256 प्राकृतिक संस्करण डेटा से i40-699 इंडेल्स को एक अलग अध्ययन 39 में कस्टम R 38 स्क्रिप्ट का उपयोग करके निकाला गया था। हमने यह सुनिश्चित करने के लिए वर्मबेस संस्करण WS276 डेटा की भी जांच की कि WS256 डेटा अप-टू-डेट है। अतिरिक्त कस्टम आर लिपियों का उपयोग करते हुए, हमने वर्मबेस एनोटेट जीन डेटासेट का उपयोग करके जीन की आनुवंशिक और भौतिक स्थिति के साथ-साथ प्रत्येक i40-699 इंडेल से संबंधित निकटतम जीन की पहचान की। 11,556 एनोटेट किए गए i40-699 इंडल्स की एक सूची अनुपूरक तालिका S1 में भौतिक स्थिति और इंडल्स के आकार के साथ, उनकी भौतिक और आनुवंशिक स्थिति के साथ निकटतम जीन, 40 जंगली आइसोलेट्स के बीच उपस्थिति की आवृत्ति, और i40 के साथ जंगली आइसोलेट्स हैं। 699 इंडेल।

प्राइमरों को डिजाइन करने में, हमने एक समान पीसीआर स्थिति और एन 2 और सीबी 4856 एचए डीएनए के आसान भेद का लक्ष्य रखा। उदाहरण के लिए, हमने आसान अंतर के लिए CB4856 की तुलना में लंबे N2 डीएनए वाले i40-699 indels को चुना। समान एनीलिंग तापमान के लिए, इष्टतम गलनांक Tm 60 ଌ पर सेट किया गया था। समान बढ़ाव समय के लिए, हमने N2 और CB4856 उत्पादों के आकार को एक संकीर्ण सीमा के भीतर रखा। अंतिम प्राइमर सेट के साथ, N2 उत्पाद का आकार 500 और 1500 bp के बीच होता है जबकि CB4856 उत्पाद का आकार 400 और 1300 bp के बीच होता है। पीसीआर उत्पादों को आसानी से अलग करने के लिए, हमने आमतौर पर इनडेल्स को चुना है जिनमें से 200 9100 बीपी लंबाई परिवर्तन हैं, लेकिन हमने अधिकांश मेगाबेस (एमबी) में प्रतिनिधि i40-699 इंडेल रखने के लिए कुछ इण्डेल्स को चुना ) अंतराल। अन्यथा, हमने मनमाने ढंग से i40-699 indels को चुना। जीनोम के दूसरे भाग से प्रवर्धित भ्रमित पीसीआर उत्पादों को कम करने के लिए, प्राइमर-ब्लास्ट 40 को शुरू में छह . का उपयोग करके किया गया था सी. एलिगेंस क्रोमोसोम अनुक्रम टेम्पलेट के रूप में विशिष्टता के साथ जांच करते हैं सी. एलिगेंस गैर-निरर्थक (एनआर) न्यूक्लियोटाइड डेटाबेस। अतिरिक्त प्राइमरों को फिर से प्राइमर-ब्लास्ट का उपयोग करके या उपयुक्त कॉस्मिड, फॉस्मिड या वाईएसी क्लोन अनुक्रम के साथ प्राइमर 3 41 का उपयोग करके चुना गया था, और हमने प्राइमरों का परीक्षण तब तक किया जब तक कि एक संतोषजनक प्राइमर जोड़ी की पहचान नहीं हो गई। कुल 584 प्राइमरों का परीक्षण किया गया, और सर्वश्रेष्ठ प्राइमर जोड़े को पूरक तालिका एस2 में पीसीआर उत्पादों के अपेक्षित आकार के साथ सूचीबद्ध किया गया है, दो अलग-अलग परिस्थितियों में पीसीआर की सफलता दर, 96-वेल प्लेट में स्थिति की व्याख्या जहां लागू हो, और जंगली आइसोलेट्स i40-699 इंडेल के साथ।

प्रीमिक्स्ड प्राइमर जोड़े के वर्किंग स्टॉक को 96-वेल प्लेट्स में जमे हुए रखा गया था क्योंकि 4 ଌ पर लंबे समय तक भंडारण के कारण वाष्पीकरण और संभावित गिरावट हुई। जब तक अन्यथा संकेत न दिया गया हो, वयस्क उभयलिंगी को 1 × लिसिस बफर के 10 μl में व्यक्तिगत रूप से lysed किया गया था (40 मिमी KCl, 10 मिमी Tris pH 8.3, 2.5 मिमी MgCl)2, 0.45% IGEPAL, 0.45% ट्वीन 20) प्रोटीनएज़ K के साथ 60 μg/ml अंतिम एकाग्रता पर लसीका से पहले जोड़ा गया। 8-स्ट्रिप ट्यूबों का उपयोग करके 15 मिनट के लिए 95 ଌ पर निष्क्रियता के साथ 65 ଌ पर 1 घंटे के लिए विश्लेषण किया गया था। लाइस्ड वर्म्स को अक्सर मिश्रित या पूल किया जाता था, और संयुक्त नमूनों को अक्सर पानी से पतला किया जाता था या 1 ×  लिसिस बफर जिसमें प्रोटीनएज़ K की कमी होती थी। पीसीआर को टैक पोलीमरेज़ के लिए डिटर्जेंट के बिना मानक स्थितियों का उपयोग करके 25 µl मात्रा में किया गया था। वाष्पीकरण को कम करने के लिए 96-वेल प्लेटों के लिए एल्यूमीनियम पन्नी सील के साथ पीसीआर के लिए 8-स्ट्रिप ट्यूब या 96-वेल प्लेट्स का उपयोग किया गया था। पीसीआर तापमान साइक्लर की स्थिति थी: 5′ 95 ଌ, 35 चक्र (30″ 95 ଌ, 30″ 60 ଌ, 2′ 72 ଌ), 5′ 72 &# x000b0C. पीसीआर उत्पादों को 2% agarose जेल पर 40 मिनट के लिए 40 मिनट के लिए वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग करने के बाद कल्पना की गई थी 

𠂑.5 एल ट्रिस–एसेटेट-ईडीटीए रनिंग बफर जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया गया हो। आवर्ती खराब पीसीआर परिणामों को आमतौर पर 1 × लिसिस बफर की नई तैयारी और 1 × लिसिस बफर के पुराने स्टॉक को हटाकर ठीक किया गया था, जो कई महीनों के बाद कम प्रभावी हो सकता है।

मैपिंग के लिए F2 म्यूटेंट प्राप्त करने के लिए, CB4856 पुरुषों को म्यूटेंट हेर्मैफ्रोडाइट्स ऑफ़ इंटरेस्ट के साथ रखा गया था। इसके बाद, F1 विषमयुग्मजी उभयलिंगी को नई प्लेटों में L4 लार्वा के रूप में रखा गया ताकि स्व-निषेचन द्वारा F2 संतान को पुन: उत्पन्न किया जा सके। अंत में, F2 समयुग्मजी म्यूटेंट को उनके उत्परिवर्ती फेनोटाइप द्वारा पहचाना गया, जो स्पष्ट (Clr) और ब्लिस्टरिंग बॉडी 42, स्क्वैश वल्वा (Sqv) L4 लार्वा चरण 43 में हो सकता है और साइटोकाइनेसिस 44 में अक्षम भ्रूण के एक स्टीरियोटाइपिकल आकारिकी के साथ संबद्ध बाँझपन हो सकता है, या ए तापमान पर निर्भर संवैधानिक dauer उत्परिवर्ती फेनोटाइप 45। तापमान पर निर्भर डाउर म्यूटेंट के संग्रह में भ्रूण और एल1 लार्वा की मिश्रित आबादी को 28 ଌ पर 10 दिनों के लिए भरपूर मात्रा में उपस्थिति में रखना शामिल है। ई कोलाई 20 ଌ पर लौटने से पहले भोजन के रूप में काम करने वाले बैक्टीरिया उत्परिवर्ती डाउर बचे लोगों को उत्परिवर्ती उपजाऊ वयस्क बनने की अनुमति देते हैं।

तापमान पर निर्भर संवैधानिक डाउर उत्परिवर्ती फेनोटाइप का उपयोग करके पूरक परीक्षण कुछ अलग दृष्टिकोणों का उपयोग करके किए गए थे। के लिये iw108 गुणसूत्र X में स्थित है, या तो डीएएफ -3 (ओके 3610) या डीआईएफ -11 (पीई554) उत्परिवर्ती हेर्मैफ्रोडाइट्स को एन 2 पुरुषों के साथ रखा गया था, और एफ 1 हेमिज़ेगस म्यूटेंट एक्सओ पुरुषों को या तो साथ रखा गया था डीएएफ -3 (आईडब्ल्यू 108) या dpy-17(e164) un-79(e1068) daf-3(iw108) उत्परिवर्ती उभयलिंगी। F2 संतान की मिश्रित आबादी को 10 दिनों के लिए 28 ଌ तक ले जाया गया और बाद में 20 ଌ में स्थानांतरित कर दिया गया, और जीवित पुरुषों की उपस्थिति में गैर-डीपीई गैर-यूएनसी उपजाऊ वयस्क उभयलिंगी की तलाश की गई। डौअर बचे जो वयस्क पुरुष बन गए थे, उनका उपयोग उपजाऊ उभयलिंगी की अनुपस्थिति के साथ सफल संभोग का आकलन करने के लिए किया गया था, जो कोई पूरक नहीं दर्शाता है। परीक्षणों के साथ डीएएफ -3 (आईडब्ल्यू 108) उभयलिंगी उत्परिवर्ती बिना डीपीआई-17 या संयुक्त राष्ट्र-79 उत्परिवर्तन, डाउर उत्तरजीवी जो उपजाऊ वयस्क उभयलिंगी बन गए थे, की जांच पीसीआर का उपयोग करके की गई ताकि ब्याज के उत्परिवर्तन की उपस्थिति या अनुपस्थिति की पुष्टि की जा सके। इसी तरह के दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया गया था आईडब्ल्यू107 गुणसूत्र X में भी स्थित है। यहाँ, इनमें से एक चे-2(e1033), डीएएफ -3 (ओके 3610), डीआईएफ -11 (पीई554), रंड-1(gk901813), osm-5(p813), या आईडब्ल्यू107 म्यूटेंट हेर्मैफ्रोडाइट्स को N2 पुरुषों के साथ रखा गया था, और F1 हेमीज़ीगस म्यूटेंट पुरुषों को इनमें से एक के साथ रखा गया था। चे-2 (iw107), dpy-17(e164) un-79(e1068) che-2(iw107), dpy-17(e164) unc-79(e1068) che-2(e1033), dpy-17(e164) un-79(e1068) dyf-11(pe554), या dpy-17(e164) un-79(e1068) osm-5(p813) उभयलिंगी। के साथ एक अलग दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था आईडब्ल्यू109 गुणसूत्र II में स्थित है। यहां, चे-10(ई1809) उत्परिवर्ती हेर्मैफ्रोडाइट्स को N2 पुरुषों के साथ रखा गया था, और विषमयुग्मजी F1 पुरुषों को या तो . के साथ रखा गया था चे-10(iw109) या dpy-17(e164) unc-79(e1068) che-10(iw109) उत्परिवर्ती उभयलिंगी। 28 ଌ पर 10 दिनों के बाद, डाउर बचे लोगों की उपस्थिति जो पुरुष बन गए, को पूरकता के प्रमाण के रूप में इस्तेमाल किया गया।

का संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण चे-10(iw109) म्यूटेंट स्ट्रेन को नोवोजीन (en.novogene.com) के साथ निष्पादित किया गया था, उनके प्लांट और एनिमल होल जीनोम सीक्वेंसिंग सेवा का उपयोग करते हुए 20 ×  के लिए 2 जीबी डेटा आउटपुट के साथ युग्मित-अंत 150 बीपी अनुक्रमण द्वारा जीनोम का कवरेज। जेनेविज़ (www.genewiz.com) के साथ सेंगर अनुक्रमण किया गया था।


एमसीएटी - आण्विक जीवविज्ञान

1. डबल फंसे हुए डीएनए को अलग या खोलना चाहिए
• डीएनए गाइरेज़ (कक्षा II टोपोइज़ोमेरेज़) प्रतिकृति फोर्क के आगे डीएनए को खोलने के लिए जिम्मेदार है
• डीएनए हेलिकेस प्रतिकृति फोर्क पर डीएनए को खोलने के लिए जिम्मेदार है
• हेलीकॉप्टर के बाद डीएनए को खुला रखने के लिए सिंगल-स्ट्रैंड बाइंडिंग प्रोटीन (एसएसबी) जिम्मेदार है। एसएसबी एकल-फंसे डीएनए को बांधकर स्थिर करते हैं।

2. इसके बाद, डीएनए को नए अवांछित/पृथक डीएनए के पूरक होने के लिए संश्लेषित किया जाता है। सभी जैविक डीएनए संश्लेषण 5' से 3' छोर तक होते हैं।
• प्राइमेज़ ने घाव के डीएनए पर एक छोटा आरएनए प्राइमर बिछाकर इसकी शुरुआत की। प्राइमर आरएनए से बना होता है, लेकिन डीएनए अनुक्रम का पूरक होता है। बाद में, इस आरएनए को डीएनए से बदल दिया जाता है
• डीएनए पोलीमरेज़ फिर लेता है और डीएनए बनाता है जो कि अवांछित डीएनए का पूरक है
• डीएनए संश्लेषण क्षतिग्रस्त डीएनए के दोनों स्ट्रैस पर होता है। प्रतिकृति कांटा की दिशा में आगे बढ़ने वाला संश्लेषण अग्रणी किनारा है। प्रतिकृति कांटा के विपरीत दिशा में आगे बढ़ने वाला संश्लेषण लैगिंग स्ट्रैंड है। लैगिंग स्ट्रैंड में ओकाज़ाकी टुकड़े होते हैं।


सार

क्लोरोप्लास्ट नॉनकोडिंग क्षेत्रों में सम्मिलन और विलोपन (इंडेल्स) जनसंख्या संरचना और जीन प्रवाह का अनुमान लगाने के लिए सामान्य आनुवंशिक मार्कर हैं, हालांकि पौधों के परिवारों के भीतर हाल ही में अलग-अलग वंशों के बीच अपेक्षाकृत कम विकास के बारे में जाना जाता है। क्योंकि इंडेल घटनाएं डीएनए अनुक्रमों के साथ गैर-यादृच्छिक रूप से घटित होती हैं, आवर्तक उत्परिवर्तन इंडेल हैप्लोटाइप्स के लिए होमोप्लासी उत्पन्न कर सकते हैं। यह जनसंख्या अध्ययन के लिए एक संभावित समस्या है, क्योंकि आवर्तक उत्परिवर्तन के साथ-साथ जीन प्रवाह के बाद आबादी के बीच इंडेल हैप्लोटाइप को साझा किया जा सकता है। इसके अलावा, इंडेल हैप्लोटाइप फिटनेस में भिन्न हो सकते हैं और इसलिए वंशावली के बीच दर विषमता के रूप में पता लगाने योग्य प्राकृतिक चयन के अधीन हो सकते हैं। Such selection could contribute to the spatial patterning of cpDNA haplotypes, greatly complicating the interpretation of cpDNA population structure. This study examined both nucleotide and indel cpDNA variation and divergence at six noncoding regions (psbबी-psbएच, atpबी-rbcL, trnL-trnएच, rpl20-5′rps12, trnS-trnG, and trnH-psbA) in 16 individuals from eight species in the Lecythidaceae and a Sapotaceae outgroup. We described patterns of cpDNA changes, assessed the level of indel homoplasy, and tested for rate heterogeneity among lineages and regions. Although regression analysis of branch lengths suggested some degree of indel homoplasy among the most divergent lineages, there was little evidence for indel homoplasy within the Lecythidaceae. Likelihood ratio tests applied to the entire phylogenetic tree revealed a consistent pattern rejecting a molecular clock. Tajima's 1D and 2D tests revealed two taxa with consistent rate heterogeneity, one showing relatively more and one relatively fewer changes than other taxa. In general, nucleotide changes showed more evidence of rate heterogeneity than did indel changes. The rate of evolution was highly variable among the six cpDNA regions examined, with the trnS-trnG and trnH-psbA regions showing as much as 10% and 15% divergence within the Lecythidaceae. Deviations from rate homogeneity in the two taxa were constant across cpDNA regions, consistent with lineage-specific rates of evolution rather than cpDNA region-specific natural selection. There is no evidence that indels are more likely than nucleotide changes to experience homoplasy within the Lecythidaceae. These results support a neutral interpretation of cpDNA indel and nucleotide variation in population studies within species such as Corythophora alta.


For more information about SNPs:

An audio definition of SNPs is available from the National Human Genome Research Institute’s Talking Glossary of Genetic Terms.

How scientists locate SNPs in the genome is explained by the University of Utah Genetic Science Learning Center.

For people interested in more technical data, several databases of known SNPs are available:


वह वीडियो देखें: Compréhension: polymorphismes nucléotidiques uniques et allèles bialléliques (फरवरी 2023).