जानकारी

आप एक वर्णमिति परख में विभिन्न घनत्वों पर कोशिकाओं को प्लेट क्यों करेंगे?

आप एक वर्णमिति परख में विभिन्न घनत्वों पर कोशिकाओं को प्लेट क्यों करेंगे?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

मेरे प्रयोग का उद्देश्य यह देखना है कि क्या एक काइनेज अवरोधक कैंसर कोशिका की व्यवहार्यता को कम करता है। मैं 2 अलग-अलग सेल घनत्व 50,000 कोशिकाओं/कुओं और 100,000 कोशिकाओं/कुओं और किनेज अवरोधक की विभिन्न खुराक का उपयोग कर रहा हूं।


आपने जो टिप्पणियाँ दी हैं, वे कुछ कारण हैं, हालाँकि वे कोशिकाओं के संगम पर भी निर्भर करती हैं। आपका शिक्षक/प्रोफेसर/सलाहकार यह भी सुनिश्चित कर रहा है कि आप दवा के निम्न स्तर पर प्रभाव देख सकते हैं, साथ ही यह सुनिश्चित कर रहे हैं कि संकेत में परिवर्तन दिखाई दे रहे हैं - उदाहरण के लिए, क्या दवा गतिविधि के कारण व्यवहार्यता में 50% की कमी आती है कोशिकाओं की संख्या को 50% तक कम करने के समान संकेत में गिरावट? आप यह नहीं कहते कि आप किस प्रकार का परीक्षण चला रहे हैं, लेकिन काफी सामान्य और सस्ता है एमटीटी परख, कुछ किट आजकल अधिक संवेदनशीलता के लिए एक्सटीटी पर स्विच कर रहे हैं और परख में चरणों की संख्या में कमी (उदाहरण किट) थर्मोफिशर से एमटीटी परख किट की तुलना में सेल सिग्नलिंग से), क्योंकि अंतिम वर्णमिति उत्पाद को पढ़ने से पहले घुलनशीलता की आवश्यकता नहीं होती है। अंत में, आप जिस लैब में हैं, उसके आधार पर, परख के लिए शर्तों को अभी तक अनुकूलित नहीं किया जा सकता है, इसलिए आपका प्रशिक्षक चाहता है कि आप कुछ अलग-अलग घनत्वों का परीक्षण करें ताकि यह देखा जा सके कि सबसे अच्छा काम क्या है।


सेल कल्चर के लिए उपयोगी नंबर

सेल कल्चर के लिए विभिन्न प्रकार के व्यंजन और फ्लास्क का उपयोग किया जाता है। विभिन्न आकार के कल्चर जहाजों के लिए कुछ उपयोगी संख्याएं जैसे सतह क्षेत्र और हदबंदी समाधान की मात्रा नीचे दी गई हैं।

कैटलॉग संख्यासतह क्षेत्र (सेमी 2 )बोने का घनत्व*संगम पर प्रकोष्ठ*वर्सीन
(०.०५% EDTA का एमएल)। लगभग। आयतन
ट्रिप्सिन
(0.05% trypsin के एमएल, 0.53 मिमी EDTA)। लगभग। आयतन
तरक्की का जरिया
(एमएल)। लगभग। आयतन
व्यंजन
35 मिमी1504601503188.80.3 x 10 6 १.२ x १० ६ 112
60 मिमी15046215028821.50.8 x 10 6 3.2 x 10 6 335
100 मिमी15046415035056.7२.२ x १० ६ 8.8 x 10 6 5512
150मिमी1504681683811455.0 x 10 6 20.0 x 10 6 101030
संस्कृति प्लेट
6-अच्छी तरह से1406759.60.3 x 10 6 १.२ x १० ६ 111 से 3
12-अच्छी तरह से1506283.50.1 x 10 6 0.5 x 10 6 0.4 से 10.4 से 11 से 2
24-अच्छी तरह से1424751.9०.०५ x १० ६ ०.२४ x १० ६ 0.2 से 0.30.2 से 0.30.5 से 1.0
48-अच्छी तरह से1506871.1०.०३ x १० ६ ०.१२ x १० ६ 0.1 से 0.20.1 से 0.20.2 से 0.4
96-अच्छी तरह1670080.320.01 10 6 0.04 x 10 6 0.05 से 0.10.05 से 0.10.1 से 0.2
बोतल
टी 25156367156340250.7 x 10 6 2.8 x 10 6 333–5
टी 75156499156472752.1 x 10 6 8.4 x 10 6 558–15
टी 1751599101599201754.9 x 10 6 23.3 x 10 6 171735–53
टी-2251599341599332256.3 x 10 6 30 x 10 6 222245–68
* प्रत्येक संस्कृति पोत प्रकार के लिए सीडिंग घनत्व निम्नानुसार दिया गया है: व्यंजन और फ्लास्क: प्रति पोत सेल संस्कृति प्लेट: सेल प्रति कुएं।

मिला हुआ प्लेट, डिश या फ्लास्क पर कोशिकाओं की संख्या सेल प्रकार के साथ अलग-अलग होगी। इस तालिका के लिए, हेला कोशिकाओं का उपयोग किया गया था।


साइटोटोक्सिसिटी को मापने के लिए परख प्रोटोकॉल

अतिरिक्त अभिकर्मकों की आवश्यकता:

  • संस्कृति माध्यम, जैसे, आरपीएमआई 1640 (आर0883) जिसमें 10% गर्मी निष्क्रिय एफसीएस (भ्रूण बछड़ा सीरम, 12106सी), 2 एमएम ग्लूटामाइन (जी6392) और 1 माइक्रोग्राम/एमएल एक्टिनोमाइसिन सी1 (एक्टिनोमाइसिन डी, ए9415) शामिल हैं।
  • यदि एंटीबायोटिक का उपयोग किया जाना है, तो इसके अतिरिक्त पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन या जेंटामाइसिन के साथ मीडिया को पूरक करें
  • ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α, मानव (hTNF-α) (10 माइक्रोग्राम / एमएल), बाँझ (T6674)।

शिष्टाचार:

WEHI-164 कोशिकाओं (माउस फाइब्रोसारकोमा, 87022501) पर मानव ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α (hTNF-α, T6674) के साइटोटोक्सिक प्रभाव के निर्धारण के लिए (चित्र 2).

  1. 37 डिग्री सेल्सियस और 5-6.5% सीओ पर 3 घंटे के लिए 1 माइक्रोग्राम / एमएल एक्टिनोमाइसिन सी 1 के साथ संस्कृति माध्यम में 1 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर WEHI-164 कोशिकाओं को प्रीइनक्यूबेट करें।2.
  2. 5 × 10 4 कोशिकाओं / 100 μl संस्कृति माध्यम में 1 माइक्रोग्राम / एमएल एक्टिनोमाइसिन सी 1 और एचटीएनएफ-α (अंतिम एकाग्रता जैसे, 0.001–0.5 एनजी / एमएल) की विभिन्न मात्रा में माइक्रोप्लेट्स (टिशू कल्चर ग्रेड) में बीज कोशिकाएं , 96 कुएँ, समतल तल)।
  3. 24 घंटे के लिए +37 डिग्री सेल्सियस और 5-6.5% CO . पर इनक्यूबेट सेल संस्कृतियों2.
  4. ऊष्मायन अवधि के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से एमटीटी लेबलिंग अभिकर्मक (अंतिम एकाग्रता 0.5 मिलीग्राम / एमएल) के 10 μl जोड़ें।
  5. आर्द्र वातावरण में 4 घंटे के लिए माइक्रोप्लेट इनक्यूबेट करें (उदा., +३७ डिग्री सेल्सियस, ५-६.५% सीओ2).
  6. एक अच्छी तरह से घुलनशील समाधान के 100 μl जोड़ें।
  7. प्लेट को एक आर्द्र वातावरण में इनक्यूबेटर में रात भर खड़े रहने दें (उदा., +३७ डिग्री सेल्सियस, ५-६.५% सीओ2).
  8. बैंगनी फॉर्मेज़ान क्रिस्टल के पूर्ण घुलनशीलता की जाँच करें और माइक्रोप्लेट (एलिसा) रीडर का उपयोग करके नमूनों के अवशोषण को मापें। उपयोग किए गए एलिसा रीडर के लिए उपलब्ध फिल्टर के अनुसार फॉर्मेज़ान उत्पाद के अवशोषण को मापने के लिए तरंग दैर्ध्य 550 और 600 एनएम के बीच है। संदर्भ तरंग दैर्ध्य 650 एनएम से अधिक होना चाहिए ।

चित्र 2। एमटीटी परख का उपयोग करके WEHI-164 कोशिकाओं (माउस फाइब्रोसारकोमा) पर पुनः संयोजक मानव TNF-α (hTNF-α) की साइटोटोक्सिक गतिविधि का निर्धारण।


अवलोकन

प्रोडक्ट का नाम

पता लगाने की विधि

नमूना प्रकार

परख प्रकार

परख समय

उत्पाद अवलोकन

एक्स्ट्रासेल्युलर ऑक्सीजन खपत परख किट ab197243 एक मिक्स-एंड-रीड, 96-वेल फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर परख है जो बाह्य ऑक्सीजन खपत दरों (ओसीआर) के वास्तविक समय गतिज विश्लेषण के लिए है। ऑक्सीजन की खपत दर सेलुलर श्वसन दर और माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का एक उपाय है।

परख को पृथक माइटोकॉन्ड्रिया और सेल संस्कृतियों के लिए अनुकूलित किया गया है, और इसका उपयोग ऊतकों, एंजाइम की तैयारी और छोटे जीवों के साथ किया जा सकता है।

इस परख किट में प्रयुक्त फ्लोरोसेंट डाई को ऑक्सीजन द्वारा बुझाया जाता है। डाई 360-380 एनएम (अधिकतम 380) पर उत्तेजित होती है और 630-680 एनएम (अधिकतम 650) पर उत्सर्जित होती है। यह अलग से ab197242 के रूप में भी उपलब्ध है।

परख में, परख माध्यम में ऑक्सीजन के प्रसार को सीमित करने के लिए परख माध्यम के ऊपर एक तेल की परत डाली जाती है। चूंकि माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन परख माध्यम के भीतर ऑक्सीजन को कम कर देता है, फ्लोरोसेंट डाई की शमन कम हो जाती है, और प्रतिदीप्ति संकेत आनुपातिक रूप से बढ़ जाता है।

प्रतिक्रिया गैर-विनाशकारी और पूरी तरह से प्रतिवर्ती है (ऑक्सीजन संवेदनशील डाई का सेवन नहीं किया जाता है) परख समय पाठ्यक्रम और दवा उपचार को सक्षम करता है।

टिप्पणियाँ

या मेटाबोलाइट्स, चयापचय एंजाइम, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए अन्य परख के लिए पूर्ण चयापचय परख गाइड की समीक्षा करें।


गैर-आयनिक मीडिया में Isopycnic centrifugation

ग्रेडिएंट्स के विश्लेषण को प्रभावित करने वाले कारक

जैसा कि पहले कहा गया है, सैकरिडिक विलेय एंजाइमों की गतिविधि को रोकते हैं, और कुछ एंजाइम दूसरों की तुलना में अधिक संवेदनशील होते हैं। इसलिए, एक ढाल में मार्कर एंजाइमों के वितरण का अध्ययन करते समय प्रत्येक परख में सुक्रोज सांद्रता को समायोजित किया जाना चाहिए ताकि वे समान हों। सुक्रोज ग्लाइकोजन के आकलन, आरएनए के ऑरसिनॉल अनुमान, डीएनए के डिफेनिलमाइन अनुमान, प्रोटीन के सूक्ष्म-बाय्यूरेट आकलन में भी हस्तक्षेप करता है और लोरी प्रोटीन परख प्रक्रिया (हिंटन, बर्ज और हार्टमैन, 1969 हार्टमैन) की संवेदनशीलता को कम करता है। और अन्य।, 1974)। हालांकि, मोनोसेकेराइड और डिसैकराइड को आसानी से हटाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, नमूने के एसिड-वर्षा, या कमजोर पड़ने के बाद सामग्री को पेलेट करना, या डायलिसिस।

ग्रेडिएंट फ्रैक्शंस की रेडियोधर्मिता को मापते समय, पानी में घुलनशील स्किंटिलेंट को जोड़ने से चीनी विलेय की वर्षा हो सकती है। हालांकि, नमूनों को पतला करके या स्किंटिलेंट के सावधानीपूर्वक चयन से ऐसी समस्याओं से बचा जा सकता है (देखें पृष्ठ ५४)। वर्षा की अनुपस्थिति में भी, नमूनों में सुक्रोज β-उत्सर्जक, विशेष रूप से 3 एच-लेबल वाले यौगिकों (डोब्रोटा और हिंटन, 1973) के कमजोर β-उत्सर्जन को बुझा सकता है।


कोशिकाओं की क्लोनोजेनिक परख कृत्रिम परिवेशीय

क्लोनोजेनिक परख या कॉलोनी गठन परख एक है कृत्रिम परिवेशीय एक कॉलोनी में विकसित होने के लिए एकल कोशिका की क्षमता के आधार पर कोशिका अस्तित्व परख। कॉलोनी को कम से कम 50 कोशिकाओं से मिलकर परिभाषित किया गया है। परख अनिवार्य रूप से "असीमित" विभाजन से गुजरने की क्षमता के लिए जनसंख्या में प्रत्येक कोशिका का परीक्षण करती है। क्लोनोजेनिक परख आयनकारी विकिरण के साथ उपचार के बाद कोशिका प्रजनन मृत्यु का निर्धारण करने के लिए पसंद की विधि है, लेकिन इसका उपयोग अन्य साइटोटोक्सिक एजेंटों की प्रभावशीलता को निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है। बीजयुक्त कोशिकाओं का केवल एक अंश ही उपनिवेश बनाने की क्षमता रखता है। उपचार से पहले या बाद में, कोशिकाओं को 1-3 सप्ताह में उपनिवेश बनाने के लिए उचित तनुकरण में बीज दिया जाता है। कालोनियों को ग्लूटाराल्डिहाइड (6.0% v/v) के साथ तय किया जाता है, जो क्रिस्टल वायलेट (0.5% w/v) से सना हुआ होता है और एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके गिना जाता है। विकिरण खुराक-अस्तित्व वक्र के विश्लेषण के लिए एक विधि शामिल है।


परिणाम और चर्चा

अंजीर। 2 औसत होने के बाद और मानक विचलन सहित alamarBlue® की प्रतिशत कमी को दर्शाता है। संपूर्ण संस्कृति अवधि में सब्सट्रेट ए के लिए ग्रेटर अलमारब्लू® कमी (अर्थात कोशिका वृद्धि का उच्च स्तर) मनाया जाता है। दोनों सबस्ट्रेट्स में, सेल प्रसार पहले 15 दिनों में संस्कृति के समय के साथ बढ़ा। दोनों सबस्ट्रेट्स पर बढ़ने वाली कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि 15 दिन तक धीमी हो जाती है, यह सुझाव देती है कि सतहें संगम में आगे बढ़ रही थीं।

अंजीर। 2: सब्सट्रेट ए और बी के लिए संस्कृति समय के एक समारोह के रूप में अलमारब्लू का प्रतिशत कमी।

खाद्य स्वच्छता निरीक्षण के लिए त्वरित तरीके

मैथियास उपमान, क्रिस्टीन बोनापार्ट, इनसाइक्लोपीडिया ऑफ़ फ़ूड माइक्रोबायोलॉजी, 1999 में

ऑप्टिकल तरीके

वर्णमिति और फ्लोरोमेट्री: माइक्रोबियल चयापचय गतिविधि से जुड़े विशिष्ट भौतिक या रासायनिक परिवर्तन (पीएच, ऑक्सीकरण / कमी क्षमता, एंजाइमेटिक परिवर्तन) नमूना ऊष्मायन के दौरान एक अतिरिक्त अभिकर्मक डाई के रंग, प्रतिदीप्ति या रंग तीव्रता में परिवर्तन द्वारा इंगित किया जा सकता है। दिखाए जाने वाले चयापचय परिवर्तन के आधार पर कई क्रोमोजेनिक और फ्लोरोजेनिक रंगों का उपयोग किया जाता है। शुद्ध संस्कृतियों के लिए कई लघु और कंप्यूटर सहायता प्राप्त या यहां तक ​​कि पूरी तरह से स्वचालित पहचान प्रणाली इस सिद्धांत पर आधारित हैं।

रंगीन प्रतिक्रिया या फ्लोरोक्रोम गठन का उत्पादन करने के लिए आवश्यक ऊष्मायन समय को मापकर मात्रात्मक उद्देश्यों के लिए वर्णमिति और फ्लोरोमेट्री का भी उपयोग किया जा सकता है। व्यापक रूप से ज्ञात संकेतक लिटमस और ब्रोमोक्रेसोल पर्पल हैं जो पीएच शिफ्ट या रेसज़ुरिन, मेथिलीन ब्लू और ट्राइफेनिलटेट्राजोलियम क्लोराइड को ऑक्सीकरण / कमी संकेतक के रूप में पता लगाते हैं।

पूरी तरह से स्वचालित प्रक्रियाएं अब उपलब्ध हैं जो परावर्तन वर्णमापी या फ्लोरोमीटर का उपयोग करती हैं। ये तकनीकें उत्पाद की शेल्फ लाइफ स्थिरता, स्टार्टर कल्चर गतिविधि और एंटीबायोटिक परीक्षण के लिए कुल माइक्रोबियल संख्या या विशिष्ट सूक्ष्मजीवों के तेजी से आकलन के लिए लागू होती हैं। फर अधिक विवरण तालिका 2 देखें।

टर्बिडीमेट्री: सेल संख्या बढ़ने से तरल विकास मीडिया के ऑप्टिकल घनत्व में वृद्धि होती है। इसलिए, जब एक तरल नमूना ऊष्मायन किया जाता है, तो एक प्रकाश किरण तेजी से कमजोर हो जाएगी। नमूना कमजोर पड़ने, विकास माध्यम और ऊष्मायन तापमान को अलग करके परिणाम को विशिष्ट जीवाणु प्रजातियों या संख्याओं तक सीमित किया जा सकता है। कुछ कार्यप्रणाली गुण तालिका 2 में दिए गए हैं।

टर्बिडीमेट्री व्यापक रूप से विटामिन बायोएसे और कीटाणुनाशक परीक्षण में लागू होती है। इसका उपयोग खाद्य गुणवत्ता नियंत्रण में बाँझपन परीक्षण के लिए किया गया है। इसका अनुप्रयोग खाद्य पदार्थों की पृष्ठभूमि मैलापन (वसा ग्लोब्यूल्स, रक्त कोशिकाओं, खाद्य कणों) द्वारा सीमित हो सकता है।

पाइरूवेट निर्धारण: पाइरूवेट जीवाणु लैक्टोज चयापचय में एक प्रमुख यौगिक है और दूध की गुणवत्ता की निगरानी के लिए एक संकेतक के रूप में काम कर सकता है। पाइरूवेट को अप्रत्यक्ष रूप से कम निकोटिनमाइड-एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (एनएडीएच) के स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक डिटेक्शन द्वारा मापा जाता है जो पाइरूवेट के एंजाइमेटिक ब्रेकडाउन में एक कॉफ़ेक्टर है। चूंकि दैहिक कोशिकाएं दूध की पाइरूवेट सामग्री में योगदान करती हैं और सभी बैक्टीरिया पाइरूवेट का उत्पादन नहीं करते हैं, इस मेटाबोलाइट और कुल माइक्रोबियल गिनती के बीच संबंध सीमित है (तालिका 2 देखें)।


एमटीटी और एमटीएस परख के बीच समानताएं

  • एमटीटी और एमटीएस परख दो प्रकार के परख हैं जो इन विट्रो में सेल व्यवहार्यता निर्धारित करते हैं।
  • दोनों परख कोशिका प्रसार और साइटोटोक्सिसिटी पर परीक्षण अणुओं के प्रभाव का आकलन करने में मदद करते हैं।
  • इसके अलावा, दोनों वर्णमिति परख हैं।
  • इसके अलावा, वे कोशिकाओं की क्षमता के आधार पर कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि का आकलन करते हैं ताकि टेट्राजोलियम डाई को उसके फॉर्मेज़ान में कम किया जा सके।
  • इसके अलावा, उपरोक्त कमी के लिए जिम्मेदार एंजाइम एनएडी (पी) एच-निर्भर सेलुलर ऑक्सीडोरक्टेज है, जो व्यवहार्य कोशिकाओं में मौजूद है।
  • इसके अलावा, प्लाज्मा झिल्ली इलेक्ट्रॉन परिवहन द्वारा कोशिका के बाहर कमी प्रतिक्रिया होती है।
  • एमटीटी अभिकर्मक प्रकाश के प्रति संवेदनशील है इसलिए, इन परखों को अंधेरे में करना पड़ता है।
  • इसके अलावा, टेट्राजोलियम डाई को जोड़ने के बाद दोनों परखों के लिए ऊष्मायन समय समान है और यह 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 से 4 घंटे है।

कवक बायोफिल्म के निर्माण के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य 96-वेल प्लेट-आधारित विधि और एंटिफंगल संवेदनशीलता परीक्षण के लिए इसका अनुप्रयोग

पिछले दशकों में फंगल संक्रमण की घटनाओं में काफी वृद्धि हुई है। बहुत बार ये संक्रमण प्रत्यारोपित बायोमैटिरियल्स और/या मेजबान सतहों पर बायोफिल्म निर्माण से जुड़े होते हैं। इसके महत्वपूर्ण नैदानिक ​​निहितार्थ हैं, क्योंकि कवक बायोफिल्म ऐसे गुण प्रदर्शित करते हैं जो प्लवक (मुक्त-जीवित) आबादी से नाटकीय रूप से भिन्न होते हैं, जिसमें एंटिफंगल एजेंटों के प्रतिरोध में वृद्धि शामिल है। यहां हम कवक बायोफिल्म के गठन के लिए एक तीव्र और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ९६-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर-आधारित विधि का वर्णन करते हैं, जो ऐंटिफंगल संवेदनशीलता परीक्षण के लिए आसानी से अनुकूलनीय है। यह मॉडल टेट्राजोलियम नमक (2,3-बीआईएस (2-मेथॉक्सी-4-नाइट्रो-5-सल्फो-फिनाइल) -2एच-टेट्राजोलियम-5-कार्बोक्सानिलाइड) को पानी में कम करने के लिए मेटाबॉलिक रूप से सक्रिय सेसाइल कोशिकाओं की क्षमता पर आधारित है। घुलनशील नारंगी फॉर्मेज़ान यौगिक, जिसकी तीव्रता तब एक माइक्रोटिटर-प्लेट रीडर का उपयोग करके निर्धारित की जा सकती है। पूरी प्रक्रिया को पूरा होने में लगभग 2 d लगते हैं। यह तकनीक बायोफिल्म निर्माण और परिमाणीकरण को सरल बनाती है, जिससे यह विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच अधिक विश्वसनीय और तुलनीय हो जाती है, जो बायोफिल्म के एंटिफंगल संवेदनशीलता परीक्षण के मानकीकरण की दिशा में एक आवश्यक कदम है।


वह वीडियो देखें: 7867867861 (फरवरी 2023).