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१.१३: परिवर्तन - जीव विज्ञान

१.१३: परिवर्तन - जीव विज्ञान


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सीखने के मकसद

लक्ष्य:

  • समझाइए कि किसी जीन में कूटबद्ध सूचना को a के रूप में कैसे व्यक्त किया जाता है विशेषता
  • क्लोनिंग जीन में परिवर्तन की भूमिका का वर्णन करें
  • परिवर्तन प्रयोग में प्रत्येक नियंत्रण के उद्देश्य की व्याख्या करें

छात्र सीखने के परिणाम:

इस प्रयोगशाला के पूरा होने पर, छात्र निम्न में सक्षम होंगे:

  • एक परिवर्तन करना
  • नकारात्मक नियंत्रण और प्लास्मिड युक्त एंटीबायोटिक युक्त और पोषक तत्व अगर केवल मीडिया दोनों पर प्रतिक्रिया के विकास के परिणामों की भविष्यवाणी करें
  • अपने तर्क की व्याख्या करें, यदि अनुमानित वृद्धि परिणाम वास्तविक वृद्धि परिणामों से मेल नहीं खाते हैं

परिचय

जेनेटिक इंजीनियरिंग या डीएनए तकनीक मानव रोगों के इलाज के लिए बड़ी मात्रा में विशिष्ट प्रोटीन के उत्पादन के लिए उपयोगी रही है। उदाहरण के लिए, मधुमेह, हीमोफिलिया या एनीमिया के रोगियों को इंसुलिन, क्लॉटिंग फैक्टर और ग्रोथ फैक्टर प्रोटीन के साथ उपचार की आवश्यकता होती है। लक्षित जीन (डीएनए) को प्रतिबंध एंजाइमों के साथ काटा जा सकता है और एंजाइम लिगेज के साथ अन्य डीएनए के साथ जोड़ा जा सकता है। एक क्लोनिंग वेक्टर का उपयोग पुनः संयोजक डीएनए को जीवित कोशिकाओं में ले जाने के लिए किया जाता है, ताकि कोशिकाएं एन्कोडेड प्रोटीन को संश्लेषित कर सकें। सबसे अच्छे क्लोनिंग वैक्टर आकार में छोटे होते हैं, अपने डीएनए को दोहराने में सक्षम होते हैं, इसमें प्रतिबंध एंजाइम मान्यता स्थल होते हैं, और एक मार्कर जीन (आमतौर पर एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन) होता है। इस प्रयोगशाला में, हम क्लोनिंग वेक्टर के रूप में एक पुनः संयोजक प्लास्मिड का उपयोग करेंगे। इस पुनः संयोजक प्लास्मिड में शामिल हैं (1) a प्रमोटर जो सक्षम बनाता है प्रतिलिपि वांछित जीन की, (2) डीएनए प्रतिकृति की शुरुआत के लिए एक क्रम (मूल साइट), और (3) एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन।

पुनः संयोजक प्लास्मिड के साथ बैक्टीरिया को बदलना

प्लास्मिड वेक्टर में जीन को सम्मिलित करना जीन क्लोनिंग प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण पहला कदम है। हालांकि, यदि अंतिम लक्ष्य एक विशेष प्रोटीन की एक बड़ी मात्रा का उत्पादन करना है, तो प्लास्मिड को यह सुनिश्चित करने के लिए दोहराना होगा कि जीन की कई प्रतियां हैं और रुचि के जीन को होना चाहिए व्यक्त, यानी जीन का उपयोग एन्कोडेड प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए किया जाता है। दोनों गतिविधियाँ केवल एक कोशिका के अंदर ही हो सकती हैं। इसलिए, इस लैब में हम डालेंगे a पुनः संयोजक में प्लाज्मिड ई कोलाई एक प्रक्रिया के माध्यम से बैक्टीरिया जिसे कहा जाता है परिवर्तन, इसलिए नाम दिया गया क्योंकि यह बैक्टीरिया की डीएनए सामग्री को बदल देता है।

प्लास्मिड बैक्टीरिया द्वारा ले लिया जाएगा जहां यह दोहराता है, और इसके जीन को जीवाणु सेलुलर मशीनरी का उपयोग करके व्यक्त किया जाएगा। यदि प्लास्मिड वेक्टर में रुचि का एक जीन डाला गया है, तो बैक्टीरिया उस जीन द्वारा एन्कोड किए गए उत्पाद का उत्पादन करता है।

इस अभ्यास में, आप का परिवर्तन करेंगे ई कोलाई एक पुनः संयोजक प्लास्मिड का उपयोग करने वाले बैक्टीरिया जिसमें एक जीन होता है जो रंगीन प्रोटीन पैदा करता है।

जीवाणु परिवर्तन

एक बार एक पुनः संयोजक प्लास्मिड बना दिया जाता है जिसमें रुचि का एक जीन होता है, जैसे कि इंसुलिन, प्लास्मिड परिवर्तन नामक प्रक्रिया द्वारा जीवाणु कोशिकाओं में प्रवेश कर सकता है। चित्र 13.1 परिवर्तन को दर्शाता है। एक जीवाणु कोशिका के वातावरण से डीएनए का अवशोषण प्रकृति में बहुत कम दक्षता के साथ होता है। ई कोलाई बैक्टीरिया में जटिल प्लाज्मा झिल्ली होती है जो बाहरी वातावरण को कोशिका के आंतरिक वातावरण से अलग करती है और सावधानीपूर्वक नियंत्रित करती है कि कौन से पदार्थ कोशिका में प्रवेश कर सकते हैं और बाहर निकल सकते हैं। इसके अलावा, कोशिका भित्ति ऋणात्मक रूप से आवेशित होती है और ऋणात्मक रूप से आवेशित डीएनए अणुओं को पीछे हटाती है।

कोशिकाएं जिनका इलाज किया गया है सक्षम अपने आसपास के वातावरण से डीएनए लेने में अधिक कुशल हैं। कैल्शियम के घोल से जीवाणुओं का उपचार करके सक्षम कोशिकाएँ बनाई जा सकती हैं। कैल्शियम आयन सकारात्मक रूप से चार्ज होते हैं, और नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए बाहरी झिल्ली को बेअसर कर देंगे ई कोलाई बैक्टीरिया। सकारात्मक चार्ज के साथ अब झिल्ली को कोटिंग कर रहा है, स्वाभाविक रूप से नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए डीएनए अणु प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से और सेल में चले जाएंगे। गर्मी के झटके में कोशिकाओं पर जोर देकर परिवर्तन दक्षता को और बढ़ाया जा सकता है। कोशिकाओं के तापमान को ठंडे से गर्म में बदलने से, प्लाज्मा झिल्ली अधिक तरल हो जाती है और उनमें छिद्र बन जाती है। प्लास्मिड डीएनए इन छिद्रों के माध्यम से पर्यावरण से यात्रा कर सकता है और कोशिका में प्रवेश कर सकता है। कोशिकाओं को फिर ठंडे तापमान में वापस गिरा दिया जाता है, जिससे छिद्र बंद हो जाते हैं और प्लास्मिड डीएनए कोशिका के अंदर रहता है।

हालांकि, सक्षम कोशिकाएं भी हमेशा प्लास्मिड से आगे नहीं बढ़ पाती हैं। कुछ प्लास्मिड डीएनए अणुओं के लिए, 10,000 कोशिकाओं में से केवल 1 को ही रूपांतरित किया जाएगा। जब प्लास्मिड में इतनी कम कोशिकाएं ले ली जाती हैं, तो आप रूपांतरित कोशिकाओं की पहचान कैसे कर पाएंगे? एक पुनः संयोजक प्लास्मिड को डिजाइन करते समय, आवश्यकताओं में से एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध के लिए एक जीन जोड़ना है। इस तरह, बैक्टीरिया को मीडिया में एक एंटीबायोटिक के साथ जोड़ा जा सकता है, और केवल वे कोशिकाएं जिनमें प्रतिरोध जीन होता है, जैसे कि वे जो पुनः संयोजक प्लास्मिड को व्यक्त करते हैं, विकसित हो पाएंगे।

प्लास्मिड डीएनए से प्रोटीन तक

एक पुनः संयोजक प्लास्मिड एक जीवाणु कोशिका में प्रवेश करने के बाद, कोशिका उस पर जीन को व्यक्त करना शुरू कर देती है। डीएनए पोलीमरेज़ का पता लगाता है मूल- प्रतिकृति की उत्पत्ति, और जीवाणु कोशिका की मशीनरी का उपयोग करके प्लास्मिड को दोहराना शुरू कर देता है। पुनः संयोजक प्लास्मिड की कई प्रतियां जीवाणु कोशिका को बड़ी मात्रा में प्रोटीन व्यक्त करने में सक्षम कर सकती हैं। आमतौर पर, एक जीवाणु कोशिका केवल रुचि का प्रोटीन बनाती है, ऐसा करने के लिए प्रेरित होने के बाद एक रसायन जोड़कर जो जीन के प्रतिलेखन को बढ़ावा देगा। याद रखें कि पुनः संयोजक प्लास्मिड पर प्रोटीन को कूटने वाले जीन को व्यक्त करने के लिए, डीएनए को एमआरएनए में स्थानांतरित किया जाता है, जिसे तब प्रोटीन में अनुवादित किया जाता है (चित्र 13.2)। बैक्टीरिया कालोनियों को देखते हुए व्यक्त प्रोटीन दृश्य लक्षणों को प्रभावित कर सकते हैं।

पुनः संयोजक प्लास्मिड और आनुवंशिक इंजीनियरिंग के अन्य रूप संभव हैं क्योंकि सभी जीवित जीव डीएनए का उपयोग आनुवंशिक जानकारी को एन्कोड करने के लिए एक मंच के रूप में करते हैं। विभिन्न जीवों के जीन बैक्टीरिया जैसे अन्य जीवों में व्यक्त किए जा सकते हैं क्योंकि वे डीएनए में एन्कोडेड होते हैं। डीएनए निर्देशों को स्थानांतरित किया जा सकता है, और अन्य जीव विदेशी लक्षण व्यक्त कर सकते हैं।

प्रोटीन के अंदर और कोशिकाओं के कई अलग-अलग कार्य होते हैं। वे छोटे उप-इकाइयों से बने होते हैं, अमीनो अम्ल, जो डीएनए द्वारा एन्कोडेड हैं न्यूक्लियोटाइड. एक विशिष्ट तीन न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम जो एक एकल अमीनो एसिड के लिए कोड कहलाता है a कोडन उदाहरण के लिए, अमीनो एसिड ट्रिप्टोफैन के लिए कोडन टीटीजी कोड, जबकि अमीनो एसिड लाइसिन के लिए कोडन एएजी कोड। कई मामलों में, एक से अधिक कोडन एक ही अमीनो एसिड को एन्कोड कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एएए भी लाइसिन के लिए एक कोडन है। इसके अलावा, सूचनात्मक कोडन भी हैं, जैसे कि कोडन शुरू करो (एटीजी) और कोडन बंद करो (टीटीए), जो दर्शाता है कि डीएनए अनुक्रम में प्रोटीन के लिए कोड कहां से शुरू होता है और समाप्त होता है।

प्लास्मिड के साथ बैक्टीरिया को बदलना

इस प्रयोगशाला प्रयोग में आप रूपांतरित होंगे ई कोलाई प्लास्मिड के साथ बैक्टीरिया कोशिकाएं। आप उपयोग कर रहे होंगे ई कोलाई जिसे कैल्शियम क्लोराइड उपचार के साथ सक्षम बनाया गया है, और दो अलग-अलग परीक्षण समूह बनाते हैं: एक नकारात्मक नियंत्रण सेल समूह जिसमें इसमें प्लास्मिड नहीं मिला है, और प्रायोगिक समूह जिसमें प्लास्मिड जोड़ा गया है। कोशिकाओं के हीट-शॉक होने के बाद, उन्हें विभिन्न परीक्षण स्थितियों में उगाया जाएगा:

  • पोषक तत्व अगर पर नियंत्रण समूह (एक प्रकार का विकास माध्यम जिस पर बैक्टीरिया पनपते हैं)।
  • पोषक तत्व अगर पर नियंत्रण समूह एक एंटीबायोटिक के साथ जोड़ा गया।
  • पोषक तत्व अगर पर प्रायोगिक समूह।
  • एक एंटीबायोटिक के साथ अगर पोषक तत्व पर प्रायोगिक समूह।
  • पोषक तत्व अगर, एंटीबायोटिक और एक इंड्यूसर (जैसे आईपीटीजी) पर प्रायोगिक समूह।

इन परिस्थितियों में बैक्टीरिया के विकास की जांच करके, आप यह सत्यापित कर सकते हैं कि आपकी प्रक्रिया ने काम किया है, और आप जोड़े गए प्लास्मिड के साथ परिवर्तित बैक्टीरिया की पहचान कर सकते हैं। आपको कैसे पता चलेगा कि आप सफल हैं? प्लास्मिड के उदाहरणों में हमने इस अभ्यास के लिए सिफारिश की है, पुनः संयोजक बैक्टीरिया में एक नया और अत्यधिक दृश्यमान गुण होगा: यह अब रंगीन प्रोटीन का उत्पादन करेगा, जो कोशिकाओं को स्वयं रंगीन बनाता है! जैसे ही बैक्टीरिया मीडिया पर गुणा करते हैं, वे कॉलोनियों नामक कोशिकाओं के दृश्य संग्रह बनाते हैं। प्रत्येक कॉलोनी मूल जीवाणु कोशिका के मृतक का प्रतिनिधित्व करती है जो उस स्थान पर माध्यम पर उतरी और दोहराने लगी। इस प्रकार कॉलोनियां उस कोशिका के क्लोन (सटीक प्रतियां) हैं, जिन्होंने प्रतिकृति प्रक्रिया शुरू की थी।

आपके प्लास्मिड के प्रासंगिक घटक रंगीन प्रोटीन के लिए जीन, इंड्यूसिबल प्रमोटर और एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन हैं (ampR) NS ampR जीन एंटीबायोटिक एम्पीसिलीन के लिए प्रतिरोध प्रदान करता है। (जैव प्रौद्योगिकीविद इन जीनों को कहते हैं चयन योग्य मार्कर क्योंकि केवल जीन वाले बैक्टीरिया ही एंटीबायोटिक की उपस्थिति में जीवित रहेंगे।) यदि बैक्टीरिया में इंड्यूसर मौजूद है, तो प्रमोटर को "चालू" किया जाएगा ताकि आरएनए पोलीमरेज़ रुचि के जीन को ट्रांसक्रिप्ट कर सके। इससे प्रोटीन का उत्पादन हो सकेगा।

प्रीलैब प्रश्न

निम्नलिखित पर आपस में चर्चा करें। बाकी कक्षा के साथ अपने विचार साझा करने के लिए तैयार रहें।

  1. एम्पीसिलीन एंटीबायोटिक पेनिसिलिन का व्युत्पन्न है। यह जीवाणु कोशिकाओं में कोशिका भित्ति निर्माण को बाधित करता है जो कोशिकाओं को मारता है। हालांकि, हमारे पुनः संयोजक प्लास्मिड में एक जीन होता है जो एम्पीसिलीन को तोड़ने वाले प्रोटीन का उत्पादन करके एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रदान करता है। हम एम्पीसिलीन को परीक्षण माध्यम में क्यों शामिल करते हैं?
  2. यदि रासायनिक उत्प्रेरक की उपस्थिति में रूपांतरित कोशिकाएँ नहीं बढ़ती हैं तो क्या होगा?
  3. प्रयोग में, आप विभिन्न मीडिया संयोजनों पर कक्षों के नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों को जोड़ेंगे। आप प्रत्येक स्थिति के लिए क्या भविष्यवाणी करते हैं? भरें तालिका एक यह इंगित करके कि क्या आप विकास की भविष्यवाणी करते हैं या कोई वृद्धि नहीं करते हैं, और यदि विकास होता है, तो क्या न्यूनतम वृद्धि होगी या बहुत अधिक वृद्धि होगी।

नीचे दी गई प्रक्रियाओं को पढ़ें और अपनी लैब नोटबुक में शब्दों और फ़्लोचार्ट का उपयोग करके चरणों की रूपरेखा तैयार करें।

तालिका 1. आपके प्रयोग के लिए भविष्यवाणियां; ई. कोलाई का परिवर्तन

मध्यम

कोई प्लास्मिड नियंत्रण नहीं

प्लास्मिड के साथ उपचार

पोषक तत्व अगर

पोषक तत्व अगर + एम्पीसिलीन

पोषक तत्व अगर + एम्पीसिलीन + इंड्यूसर

बदलने ई कोलाई

सामग्री

अभिकर्मकों

  • प्लाज्मिड - माइक्रोफ्यूज ट्यूब में
  • पोषक तत्व शोरबा (एनबी) - माइक्रोफ्यूज ट्यूब में
  • सक्षम ई. कोलाई कोशिकाएं (सीसी) - माइक्रोफ्यूज ट्यूब में (सीसी ट्यूब को हमेशा बर्फ पर रखें)
  • 3 अगर प्लेट्स:

प्लेट 1: NA

प्लेट 2: NA/amp

प्लेट 3: एनए/amp/इंड

आपूर्ति और उपकरण

  • पी-20 माइक्रोपिपेट
  • पी-200 माइक्रोपिपेट
  • पिपेट टिप बॉक्स (पी-20, पी-200 के लिए)
  • माइक्रोफ्यूज ट्यूब रैक
  • दो 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब
  • स्थायी मार्कर
  • उपयोग करके फैकने योग्य दस्ताने
  • एक स्टायरोफोम कप में कुचल बर्फ (सीसी ट्यूब लेने से पहले पहले कप को बर्फ से भरें।)
  • सेल स्प्रेडर्स का पैक (ऐसा करने का निर्देश दिए जाने तक स्प्रेडर्स को पैक से न हटाएं)
  • टाइमर या घड़ी
  • फ्लोटिंग माइक्रोफ्यूज ट्यूब रैक
  • 42 डिग्री सेल्सियस पानी का स्नान
  • 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर
  • फीता
  • कूड़े का डिब्बा
  • Biohazard बैग (कोशिकाओं को संभालने वाली आपूर्ति के लिए)

सुरक्षा

अपने प्रोटोकॉल की जाँच करें और सभी सुरक्षा उपायों का पालन करें और प्रयोग करने से पहले उचित पोशाक पहनें।

अभ्यास सड़न रोकनेवाली तकनीक प्रयोग करते समय ई कोलाई या प्रयोगशाला सेटिंग में अन्य जीवित नमूने। एसेप्टिक तकनीक प्रयोग करने वाले व्यक्ति और नमूने दोनों के लिए संभावित संदूषण को सीमित करने के लिए सावधानी बरतने का अभ्यास है। कृपया निम्नलिखित ध्यान दें:

  • बैक्टीरिया के साथ काम करते समय दस्ताने पहनें।
  • दूषित क्षेत्रों को छूने से बचें जिसमें बैक्टीरिया को छूने वाली कोई भी चीज शामिल हो। यदि कोई दुर्घटना होती है, जैसे कि स्पिल, तो अपने प्रशिक्षक को ASAP को सूचित करें।
  • बैक्टीरिया के संपर्क में आने वाली सभी आपूर्तियों को या तो एक बायोहाज़र्ड बैग, या एक निर्दिष्ट बायोवेस्ट कंटेनर में डालें। इन दूषित आपूर्ति में पिपेट टिप्स, सेल स्प्रेडर्स और माइक्रोफ्यूज ट्यूब शामिल हो सकते हैं।
  • अगर प्लेट्स को इनक्यूबेटर से निकालने के बाद उन्हें हर समय बंद रखें।
  • लैब से निकलने से पहले अपने हाथों को हमेशा साबुन और पानी से 20 सेकेंड तक धोएं।

प्रक्रिया

  1. सुनिश्चित करें कि आपके पास ट्यूब रैक में सभी अभिकर्मक हैं।
  2. एक ठंडी सीसी ट्यूब लें और कुचले हुए बर्फ के प्याले में डालें। सक्षम कोशिकाओं को ठंडा रखें सभी समय. ट्यूब को रिम से पकड़ें, नीचे से नहीं।
  3. "पी-" और "पी+" के साथ दो नए माइक्रोफ्यूज ट्यूबों के शीर्ष और किनारों को लेबल करें।
  1. P- और P+ ट्यूब को CC ट्यूब के साथ बर्फ पर रखें।
    सर्वोत्तम संभव परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक चरण का ठीक से पालन किया जाए। किसी भी संभावित संदूषण को सामग्री, स्वयं और परिवेश तक सीमित करें।
  2. जोड़ें ई कोलाई सक्षम कोशिकाओं (सीसी ट्यूब) दोनों पी और पी + ट्यूबों के लिए।
  3. पी-200 पिपेट लें, 50 µ एल पर सेट करें और एक टिप पर रखें।
  4. रिम द्वारा सीसी ट्यूब को पकड़े हुए, पिपेट के साथ पहले और नो स्टॉप के बीच धीरे-धीरे पंप करके कोशिकाओं को धीरे से फिर से सस्पेंड करें (पहले प्रतिरोध बिंदु के लिए एक सौम्य डाउनवर्ड प्लंजर गति फिर शीर्ष प्लंजर स्थिति के लिए एक कोमल ऊपर की ओर गति)।
  5. P+ ट्यूब में 50 µ l की कोशिकाओं को जोड़ें और P+ ट्यूब को तुरंत बर्फ पर रखें । टिप को शार्प कंटेनर में फेंक दें।
  6. एक नया पिपेट टिप लें। पी-ट्यूब के लिए दोहराएँ। टिप त्यागें। P- और P+ दोनों ट्यूब बर्फ पर होनी चाहिए और इसमें सक्षम कोशिकाओं के 50 µ l शामिल होने चाहिए ।
  7. प्लाज्मिड को केवल P+ ट्यूब में जोड़ें।
    1. पी-20 पिपेट लें, 10 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें और एक टिप पर रखें।
    2. प्लाज्मिड के 10 µ l को निकालें और इसे P+ ट्यूब में जोड़ें । पहले और बिना रुके 2-3 बार धीरे-धीरे पंप करके एक साथ मिलाएं फिर ट्यूब को वापस बर्फ पर रखें।
  8. P- और P+ ट्यूबों को 15 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  9. जबकि ट्यूब द्रुतशीतन हैं, अपनी अगर प्लेट और मार्कर प्राप्त करें। इस चरण के दौरान प्लेटें न खोलें
    1. प्रत्येक अगर प्लेट में अलग-अलग माध्यम होते हैं- केवल पोषक तत्व अगर (एनए) में से एक, पोषक तत्व अगर + एम्पीसिलीन (एनए / एएमपी) में से एक, और पोषक तत्व अगर + एम्पीसिलीन + इंड्यूसर (एनए / एएमपी / आईएनडी) में से एक। इन्हें स्ट्राइप पैटर्न के साथ लेबल किया जा सकता है या प्लेट पर लिखा जा सकता है
    2. प्लेट न खोलें। हर प्लेट को उल्टा कर दें; अगर शीर्ष पर होना चाहिए। अगर पक्ष को 1) तारीख 2) समूह संख्या 3) वर्ग अवधि के साथ लेबल करें। प्लेट के निचले किनारे पर छोटा लिखने का प्रयास करें।
    3. इसके बाद, NA और NA/AMP प्लेटों के बीच में एक रेखा नीचे खींचें। एक आधे को "P-" और दूसरे को "P+" के रूप में लेबल किया गया है। NA/AMP/IND को केवल "P+" लेबल किया गया है। उन्हें चित्र 4 के समान दिखना चाहिए
  1. P- और P+ ट्यूबों के 15 मिनट तक बर्फ पर रहने के बाद, ट्यूबों को बर्फ पर रखें और आइस कप को 42°C वॉटर बाथ पर ले आएं। आपको अपने टाइमर/घड़ी की भी आवश्यकता होगी। दोनों ट्यूबों को एक फ्लोटिंग माइक्रोफ्यूज ट्यूब रैक में रखें, फिर इसे पानी के स्नान में ठीक से रखें 45 सेकंड।
  2. जैसे ही 45 सेकंड बीत जाते हैं, तुरंत ट्यूबों को वापस आइस कप में डाल दें और कम से कम 1 मिनट के लिए बर्फ पर रख दें।
  3. P- और P+ ट्यूबों में पोषक तत्व शोरबा (NB) जोड़ें।
    1. P-200 पिपेट लें, 150 µ l पर सेट करें और एक टिप पर रखें।
    2. नायब के १५० µ एल निकालें और पी-ट्यूब में जोड़ें । पिपेट के साथ पहले और नो स्टॉप के बीच धीरे-धीरे पंप करके एक साथ मिलाएं। टिप को बायोवेस्ट कंटेनर में छोड़ दें।
    3. एक नया पिपेट टिप प्राप्त करें। P+ ट्यूब के लिए भी यही प्रक्रिया दोहराएं।
  4. 15 मिनट के लिए ट्यूबों को कमरे के तापमान पर रखें। यदि आपके पास समय की कमी है, तो इस चरण को छोटा किया जा सकता है।
  5. अपने NA और NA/amp प्लेटों पर P- ट्यूब से सेल जोड़ें। प्लेट्स को दाहिनी ओर ऊपर की ओर रखें ताकि अगर नीचे की तरफ रहे। आप अगर की सतह पर कोशिकाओं को जोड़ते हैं (प्लास्टिक के ढक्कन को नहीं)।
    1. पी-200 पिपेट लें, 50 µ एल पर सेट करें और एक टिप पर रखें
    2. पी-ट्यूब लें। कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए पिपेट के साथ पहले और बिना रुके पिपेट को धीरे-धीरे पंप करें। कोशिकाओं के ५० µ l को हटा दें ।
    3. हवाई संदूषण के जोखिम को कम करते हुए, कोशिकाओं को वितरित करने के लिए एक बड़ा पर्याप्त अंतर छोड़ने के लिए एनए प्लेट के ढक्कन को "क्लैमशेल" की तरह उठाएं। कोशिकाओं के ५० µ l को प्लेट के P-आधे में जोड़ें । थाली बंद करें और कोशिकाओं को फैलाने के लिए तैयार करें।
    4. पिपेट और उसी टिप के साथ पी-ट्यूब कोशिकाओं को फिर से निलंबित करके एनए/एएमपी प्लेट के लिए इसे दोहराएं। फिर से क्लैमशेल विधि का उपयोग करके NA/AMP प्लेट के P-साइड में कोशिकाओं के 50 µ l को जोड़ें । टिप को शार्प कंटेनर में फेंक दें।
  1. अपने NA और NA/amp प्लेटों पर P-ट्यूब से कोशिकाओं को फैलाएं। आपको इस क्रम में अपनी प्लेटें फैलानी चाहिए।
    1. निष्फल सेल स्प्रेडर पैकेज खोलें। एक स्प्रेडर को बाहर निकालें और उसे केवल उस सिरे तक पकड़ें, जब तक आपने उसे हटा दिया हो। सावधान रहें कि स्प्रेडर के दूसरे छोर को कोशिकाओं और अगर के अलावा किसी भी चीज़ से न छुएं। पैकेज बंद करें।
    2. "क्लैमशेल" विधि का उपयोग करते हुए, एनए ढक्कन खोलें और कोशिकाओं को प्लेट के पी-आधे भाग पर फैलाएं। अगर की सतह के खिलाफ स्प्रेडर को धीरे से पकड़ें; इसे धीरे से व्यवहार करें जैसे कि आप जिलेटिन को संभाल रहे थे। थाली बंद करो।
    3. उसी स्प्रेडर का उपयोग करके पी-साइड पर एनए/एएमपी प्लेट के लिए उसी तकनीक को दोहराएं। एक बार जब आप समाप्त कर लें, तो स्प्रेडर को निर्दिष्ट बायोवेस्ट कंटेनर में छोड़ दें।
  2. P+ ट्यूब से अपने NA, NA/amp, और NA/amp/ind प्लेट्स में सेल जोड़ें:
    1. पी-२०० पिपेट लें, दोबारा जांच लें कि यह ५० µ एल पर सेट है और एक टिप पर रखें।
    2. पी+ ट्यूब लें। कोशिकाओं के 50 µ l को हटा दें ।
    3. एनए प्लेट को फिर से खोल की तरह सीपी के आधे हिस्से में ५० µ एल कोशिकाओं को वितरित करने के लिए एक सीपी की तरह खोलें । थाली बंद करो।
    4. पिपेट और उसी टिप के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करके एनए/एएमपी प्लेट के लिए इसे दोहराएं। P+ प्लेट के आधे भाग में ५० µ l की कोशिकाओं को जोड़ें । थाली बंद करो।
    5. पिपेट और उसी टिप के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करके NA/AMP/IND प्लेट के लिए इसे दोहराएं। कोशिकाओं के ५० µ एल जोड़ें दो बार पूरी प्लेट को। प्लेट में कुल 100 µ l की P+ कोशिकाएं जोड़ी जाती हैं और फैलते समय पूरी सतह को कवर करना चाहिए। थाली बंद करो।
  1. P+ कोशिकाओं को NA, NA/AMP और NA/AMP/IND प्लेट्स पर फैलाएं। आपको इस क्रम में अपनी प्लेटें फैलानी चाहिए।
    1. सेल स्प्रेडर पैकेज को फिर से खोलें और केवल हैंडल को छूते हुए एक स्प्रेडर निकालें। सावधान रहें कि स्प्रेडर के दूसरे छोर को कोशिकाओं और अगर के अलावा किसी भी चीज़ से न छुएं।
    2. क्लैमशेल विधि का उपयोग करते हुए, एनए ढक्कन खोलें और कोशिकाओं को प्लेट के P+ आधे हिस्से पर फैलाएं। थाली बंद करो।
    3. उसी स्प्रेडर का उपयोग करते हुए, P+ साइड पर NA/AMP प्लेट के लिए उसी तकनीक को दोहराएं।
    4. एनए/एएमपी/इंड प्लेट के लिए एक ही तकनीक दोहराएं, सिवाय इसके कि कोशिकाओं को पूरी प्लेट में फैलाया जाना चाहिए, न कि केवल एक आधा। स्प्रेडर के साथ कोशिकाओं को समान रूप से फैलाने के लिए प्लेट को धीरे से घुमाएं। एक बार जब आप समाप्त कर लें, तो स्प्रेडर को निर्दिष्ट बायोवेस्ट कंटेनर में छोड़ दें।
  2. सभी प्लेटों को 5 मिनट के लिए दाहिनी ओर रखें जब तक कि तरल पूरी तरह से प्लेट में समा न जाए। प्लेटों को एक साथ ढेर करें और उन्हें टेप करें, टेप को अपनी कक्षा अवधि, समूह संख्या और तिथि के साथ लेबल करें।
  3. संघनन को कोशिकाओं पर बनने और गिरने से रोकने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट्स को उल्टा (ऊपर की ओर की ओर) रखें ।
  4. पिपेट टिप्स, माइक्रोफ्यूज ट्यूब और सेल स्प्रेडर्स सहित बायोहाज़र्ड बैग में कोशिकाओं को छूने वाली कोई भी चीज़ डालें। टेबलटॉप को डिसइंफेक्टेंट से पोंछ लें और हाथ धो लें।
  5. 24-36 घंटों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें और विकास की तलाश करें। प्लेटें बंद रखें।
  6. ऐसा करने के लिए कहे जाने पर अगर प्लेट्स को बायोहाज़र्ड बैग में डाल दें।

विश्लेषण

  1. अपने परिवर्तन के परिणामों को देखें। भरना तालिका 2 आप विभिन्न मीडिया पर विकास देखते हैं या नहीं, इस पर टिप्पणियों के साथ।
  2. क्या आपके वास्तविक परिणाम आपके अनुमानित परिणामों से मेल खाते हैं? यदि नहीं, तो आप क्या अंतर देखते हैं और इन अंतरों के लिए कुछ स्पष्टीकरण क्या हैं?
  3. आपकी NA/AMP/IND प्लेट पर कितनी रंगीन कॉलोनियां मौजूद थीं?
तालिका 2. ई. कोलाई का परिवर्तन

मध्यम

कोई प्लास्मिड नियंत्रण नहीं

प्लास्मिड के साथ उपचार

पोषक तत्व अगर

पोषक तत्व अगर + एम्पीसिलीन

पोषक तत्व अगर + एम्पीसिलीन + इंड्यूसर

अध्ययन प्रश्न

  1. एनए/एएमपी/आईएनडी प्लेट पर रंगीन कॉलोनियां क्यों बनेंगी, न कि एनए/एएमपी प्लेट पर?
  2. एनए/एएमपी प्लेट पर रंगीन कॉलोनियों के बनने के कुछ संभावित कारण क्या हैं?
  3. बैक्टीरिया में एक्स्ट्राक्रोमोसोमल डीएनए, एक पुनः संयोजक प्लास्मिड की तरह, कोशिका के बाकी डीएनए प्रतिकृति के बिना कोशिका के भीतर दोहरा सकता है। इससे एक सेल के भीतर कई प्लास्मिड हो सकते हैं। यह महत्वपूर्ण क्यों है?
  4. पहले, आपने डीएनए, आरएनए, प्रोटीन और लक्षणों के बीच परस्पर क्रिया के बारे में सीखा। बताएं कि प्लास्मिड डीएनए में एक सम्मिलित जीन जैसे कि एक विशेषता के रूप में कैसे व्यक्त किया जाता है।
  5. बैक्टीरिया विदेशी डीएनए से प्रोटीन कैसे बना सकते हैं, जैसे मानव इंसुलिन या जेलीफ़िश जैसे ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) से प्रोटीन?
  6. क्या होगा अगर हम एम्पीसिलीन के बजाय एक अलग एंटीबायोटिक जैसे कैनामाइसिन की उपस्थिति में रूपांतरित बैक्टीरिया को बढ़ा दें?

ईएसईपी 20:1-13 (2020) - डीओआई: https://doi.org/10.3354/esep00189

सार सार: प्रकृति को वश में करने और उस पर हावी होने के लिए मानवता का स्व-निर्धारित जनादेश आधुनिक दुनिया के संज्ञानात्मक आधार का हिस्सा है - एक ऐसा दृष्टिकोण जो विज्ञान और प्रौद्योगिकी में गहराई से समाया हुआ है। समुद्री जीव विज्ञान इस मानवकेंद्रित पूर्वाग्रह से प्रतिरक्षित नहीं रहा है। लेकिन इसे बदलने की जरूरत है, और बुनियादी वैज्ञानिक विषयों और हमारे समय की वैश्विक संरक्षण अनिवार्यताओं के बीच की खाई को पाटने की जरूरत है। एक आसन्न पारिस्थितिक और जलवायु संकट का सामना करने के लिए, समुद्री जीवविज्ञानी को अपने मूल्यों और पेशेवर मानकों को उन्नत करना चाहिए और एक जलवायु और पारिस्थितिक टूटने को रोकने के लिए आवश्यक आमूल परिवर्तन को बढ़ावा देने में मदद करनी चाहिए। कुछ नुकसान को रोकने के लिए, उन्हें उस काल्पनिक रेखा को पार करना होगा जो विज्ञान को विज्ञान-आधारित सक्रियता से अलग करती है और सचेत रूप से मानव और प्राकृतिक समुदायों के स्वास्थ्य और स्थायित्व का पीछा करती है। यह अंत करने के लिए, वे (1) सम्मोहक आख्यानों को विकसित कर सकते हैं जो मानव समाज को संलग्न करते हैं, जंगली जीवित दुनिया की देखभाल पर जोर देते हैं (2) कागज पर समुद्री संरक्षण से आगे बढ़ते हैं और आत्म-अनुपालन से बचते हैं (3) बाजार में रचनात्मक परिवर्तन की वकालत करते हैं और मानव व्यवहार, न केवल क्षति का दस्तावेजीकरण करके, बल्कि यह भी स्पष्ट करके कि कैसे निष्कर्षण, उत्पादन और उपभोग प्रणाली को उन प्रथाओं से दूर किया जा सकता है जो प्रकृति को नुकसान पहुंचाती हैं (4) व्यक्तिगत और सामूहिक प्रयासों के माध्यम से राजनीति में प्रणालीगत परिवर्तन के लिए धक्का देती हैं, पर्यावरणीय सक्रियता का समर्थन करती हैं और जो लोग बायोस्फीयर-बचत नीतियों की मांग करें और (5) एक अधिक पारिस्थितिक और समग्र विश्व दृष्टि का समर्थन करें, आध्यात्मिक ज्ञान के लिए अवमानना ​​​​को त्यागें और आध्यात्मिक परंपराओं के साथ संपर्क करें (या कम से कम खारिज न करें) जो समानता, आत्म-संयम और पर्यावरणीय स्थिरता को प्रोत्साहित करती हैं।

प्रमुख शब्द: समुद्री जीव विज्ञान और मिडडॉट समुद्री संरक्षण और मिडडॉट पर्यावरण संकट और मिडडॉट जलवायु परिवर्तन और मिडडॉट जैव विविधता संरक्षण और मिडडॉट ओवरएक्सप्लॉइटेशन एंड मिडडॉट सस्टेनेबिलिटी एंड मिडडॉट आउटरीच और मिडडॉट एक्टिविज्म


सेल इंजरी, सेल्युलर रिस्पॉन्स टू इंजरी, और सेल डेथ

इतरविकसन

मेटाप्लासिया एक प्रकार की सामान्य वयस्क कोशिका से दूसरे प्रकार की सामान्य वयस्क कोशिका में रूपांतरण है। पैथोलॉजिस्ट द्वारा देखे जाने वाले सबसे सामान्य प्रकार के मेटाप्लासिया में स्क्वैमस से ग्रंथियों की कोशिकाओं में रूपांतरण शामिल है और इसके विपरीत। ग्लैंडुलर मेटाप्लासिया चोट की प्रतिक्रिया के रूप में हो सकता है, जैसा कि पेट से एसिड रिफ्लक्स के साथ डिस्टल एसोफैगस में हो सकता है। पुरानी चोट का यह रूप सूजन वाले स्क्वैमस म्यूकोसा को ग्रंथियों के म्यूकोसा में बदलने के लिए प्रेरित कर सकता है जिसमें सामान्य छोटी आंतों के म्यूकोसा की कई विशेषताएं होती हैं। मेटाप्लासिया एक सामान्य शारीरिक प्रतिक्रिया के रूप में भी हो सकता है। फिजियोलॉजिकल मेटाप्लासिया का एक उदाहरण स्क्वैमस मेटाप्लासिया है जो मासिक धर्म चक्र के दौरान गर्भाशय ग्रीवा में होता है क्योंकि स्क्वैमोकोलुमर जंक्शन परिवर्तन क्षेत्र (चित्र 1-13) में स्थानांतरित हो जाता है। हालांकि मेटाप्लासिया के कुछ रूप अनुकूली होते हैं और पुरानी चोट के प्रभाव को कम कर सकते हैं, अन्य प्रकार के मेटाप्लासिया के परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण शिथिलता हो सकती है। उदाहरण के लिए, श्वसन उपकला का स्क्वैमस मेटाप्लासिया सिगरेट पीने के परिणामस्वरूप विकसित होता है और इसके परिणामस्वरूप सामान्य म्यूकोसिलरी कंबल का नुकसान होता है, जो पर्यावरण में संक्रमण और विषाक्त पदार्थों के लिए एक प्रमुख मेजबान बाधा है। यदि उत्तेजना को हटा दिया जाता है तो मेटाप्लासिया के अधिकांश रूप प्रतिवर्ती होते हैं, जबकि कुछ (जैसे, गैस्ट्रिक एसिड रिफ्लक्स के जवाब में अन्नप्रणाली के आंतों के मेटाप्लासिया) एक बार स्थापित होने के बाद स्थायी हो जाते हैं।


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विचार - विमर्श

एमबी, सबसे आक्रामक बाल चिकित्सा ब्रेन ट्यूमर, ट्रांसक्रिप्टोम और मिथाइलेशन प्रोफाइलिंग के आधार पर चार आणविक समूहों में विभाजित किया जा सकता है: डब्ल्यूएनटी, एसएचएच, समूह 3 और समूह 4 [63]। हाल के अध्ययनों ने, हालांकि, यह प्रदर्शित किया है कि वर्तमान आणविक समूहन रोगियों के पूर्वानुमान की भविष्यवाणी करने के लिए अपर्याप्त है। उदाहरण के लिए, ट्यूमर प्रोटीन P53 (टीपी53) उत्परिवर्तन WNT और SHH-MB दोनों उपसमूहों [64] में एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक है। इसके अलावा, भ्रूण के आकारजनन में शामिल जीनों में असामान्य डीएनए मिथाइलेशन को एसएचएच उपसमूह में ऑन्कोजेनिक प्रक्रिया के संभावित चालक के रूप में भी माना जाता है, जिसका निदान 5 वर्ष की आयु (एमबी) के बाद किया जाता है।एसएचएच-बच्चे) [65]। 5mC के नुकसान के बाद से, 5mC के पहले ऑक्सीडेटिव व्युत्पन्न, ने कई घातक ट्यूमर (जैसे, उच्च-ग्रेड ग्लियोमा (GBM) और मेलेनोमा [13, 66]) के लिए एक प्रतिकूल संकेतक के रूप में कार्य किया है, हमने MB में 5hmC के परिवर्तन की जांच की। अन्य ट्यूमर प्रकारों में पूर्व निष्कर्षों के अनुरूप, हमने एमबी जीनोम में 5hmC में उल्लेखनीय कमी और 5hmC स्तरों और रोग का निदान के बीच एक मजबूत व्युत्क्रम सहसंबंध की पहचान की है। महत्वपूर्ण रूप से, हमने NANOG में एक MB-विशिष्ट 5hmC हस्ताक्षर के संवर्धन की पहचान की, जो ESCs के स्व-नवीकरण और बहुलता में शामिल एक प्रमुख प्रतिलेखन कारक है। NANOG MBs में अतिप्रवाहित है, जो विभेदन को रोकता है और ट्यूमर के स्टेमनेस को बनाए रखता है [67]। इसके अलावा, सामान्य ऊतकों की तुलना में, एमबी में 5hmC सिग्नल, सिस-एक्टिंग ट्रांसक्रिप्शन सक्रिय करने वाले तत्वों के MB सक्रिय एन्हांसर पर अधिक थे, यह सुझाव देते हुए कि 5hmC MB से जुड़े जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हमने यह भी पहचाना कि गेन-ऑफ-5hmC क्षेत्र भ्रूण विकास सिग्नलिंग मार्ग जैसे कि नॉच सिग्नलिंग मार्ग के सक्रियण में शामिल थे। नॉच सिग्नलिंग की सक्रियता न केवल स्टेम-जैसे मार्करों की अभिव्यक्ति और ट्यूमर में कोशिका वृद्धि को प्रेरित करती है, बल्कि मल्टीड्रग प्रतिरोध एबीसी (एटीपी-बाइंडिंग कैसेट) ट्रांसपोर्टर्स [68, 69] के माध्यम से दवा प्रतिरोध को भी प्रदान करती है। वास्तव में, 5hmC के गेन-ऑफ़ 5hmC पैटर्न से समानता यह दर्शाती है कि गेन-ऑफ़-5hmC MBs में स्टेम सेल जैसी गुणों को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

दस-ग्यारह ट्रांसलोकेशन (टीईटी) एंजाइम (टीईटी 1, टीईटी 2, और टीईटी 3) α-ketoglutarate-निर्भर डाइअॉॉक्सिनेज हैं जो 5mC को 5hmC [70, 71] में परिवर्तित करते हैं, और इसलिए, उनकी अभिव्यक्ति 5hmC स्तरों के साथ दृढ़ता से सहसंबद्ध होती है। दरअसल, मेलेनोमा कोशिकाओं में टीईटी 2 का ओवरएक्प्रेशन 5hmC के स्तर [72] को बढ़ाकर ट्यूमर की शुरुआत और प्रगति को दबा देता है, और अपग्रेडेड TET1 द्वारा 5hmC को बढ़ाकर ग्लियोब्लास्टोमेनेसिस [73] में शामिल जीन के पास CHOIP-मिथाइलोसोम कॉम्प्लेक्स की भर्ती करता है। आश्चर्यजनक रूप से, हमने क्लिनिकल एमबी नमूनों में 5hmC और उन्नत TET1 और TET2 का समग्र नुकसान देखा। वैश्विक हाइपोमेथिलेशन, कैंसर में क्षेत्रीय हाइपरमेथिलेशन, और 5hmC गठन [74, 75] के संदर्भ में टीईटी प्रोटीन की निरर्थक क्रियाओं के साथ-साथ फ़ंक्शन म्यूटेशन के टीईटी नुकसान की लगातार पहचान को देखते हुए, टीईटी प्रोटीन की असामान्य अभिव्यक्ति हमेशा सहसंबंध नहीं दिखा सकती है। वैश्विक 5hmC स्तर। इसके अलावा, पार करते समय टेट1 +/− चूहों के साथ स्मोए1 माउस मॉडल, जिसमें सहज एमबी विकास की एक उच्च घटना है, हमने ट्यूमर की घटनाओं और ट्यूमर की शुरुआत में नाटकीय कमी देखी है, जबकि इसका उन्मूलन टेट2 ट्यूमर की घटनाओं और उम्र की शुरुआत में बदलाव नहीं किया। इसके अलावा, shRNA- और रासायनिक रूप से मध्यस्थता का डाउनरेगुलेशन टेट1 murine और मानव ट्यूमर दोनों में कोशिका मृत्यु को बढ़ावा दिया। आगे की जांच की पहचान की गई पीडीजीएफआर तथा पीडीजीएफआरबी TET1 और NANOG द्वारा विनियमित संभावित डाउनस्ट्रीम लक्ष्यों के रूप में। के नियामक क्षेत्र पीडीजीएफआर तथा पीडीजीएफआरबी न केवल TET1 और NANOG के लिए बाध्यकारी साइट हैं, बल्कि NC की तुलना में MB में 5hmC का उच्च स्तर भी दिखाते हैं। इसके अलावा, एक TET1 अवरोधक में काफी कमी आई पीडीजीएफआरएस 'अभिव्यक्ति। यद्यपि यह निर्धारित करने के लिए अतिरिक्त जांच की आवश्यकता है कि क्या TET1 एमबी ट्यूमरजेनिसिस में एक वास्तविक ऑन्कोप्रोटीन है और क्या ओवरएक्सप्रेस्ड टीईटी 2 एमबी ट्यूमरजेनिसिस के दौरान वैश्विक 5hmC स्तर स्थापित करने के लिए TET1 के साथ सहकारी है, हमारे आनुवंशिक अध्ययन से पता चलता है कि TET1 ट्यूमर-विशिष्ट 5hmC गठन द्वारा एमबी ट्यूमरजेनिसिस को नियंत्रित करता है। नैनोग के साथ। इसके अलावा, overexpressed TET1 और ट्यूमर-विशिष्ट 5hmC हस्ताक्षर के संबंध को प्रदर्शित करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है।


परिचय

डीएनए क्लोनिंग परंपरागत रूप से एक स्रोत प्लास्मिड या डीएनए टुकड़ा और प्रतिबंध एंजाइम के साथ एक प्राप्तकर्ता वेक्टर को पचाने, एक जेल से पचने वाले टुकड़ों को निकालने और डीएनए लिगेज का उपयोग करके शुद्ध टुकड़ों को लिगेट करके किया जाता है (देखें। वर्तमान प्रोटोकॉल लेख स्ट्रुहल, 1991)। यह दृष्टिकोण एक वेक्टर में एक या दो डीएनए टुकड़ों को जोड़ने के लिए उपयुक्त है, लेकिन एक ही चरण में एक वेक्टर में कई टुकड़ों को जोड़ने के लिए अच्छी तरह से काम नहीं करता है। सौभाग्य से, नई क्लोनिंग विधियाँ उपलब्ध हैं जो एक वेक्टर में एक ही चरण में कई टुकड़ों के संयोजन की अनुमति देती हैं, जिसमें होमोलॉजी-आधारित क्लोनिंग विधियाँ (जैसे, गिब्सन असेंबली) और IIS प्रतिबंध एंजाइमों पर निर्भर विधियाँ शामिल हैं, जैसे कि गोल्डन गेट क्लोनिंग (नाम में) गेटवे क्लोनिंग के संदर्भ में, लेकिन पुल के नाम के साथ शब्द खेल के रूप में भी)। गोल्डन गेट एक थर्मल साइक्लर में प्रतिबंध-बंधाव प्रतिक्रिया का उपयोग करके किया जाता है। मानक गोल्डन गेट असेंबली प्रतिक्रिया को स्थापित करने और निष्पादित करने के लिए पैरामीटर मूल प्रोटोकॉल 1 में वर्णित हैं और चित्र 1 में उल्लिखित हैं। गोल्डन गेट क्लोनिंग के लिए आवश्यक है कि विशिष्ट प्रतिबंध साइटों की उपस्थिति या अनुपस्थिति के संबंध में वेक्टर और आवेषण की एक विशिष्ट संरचना हो। एक नियमित क्लोनिंग वेक्टर को गोल्डन गेट-संगत क्लोनिंग वेक्टर में परिवर्तित करने की एक विधि बेसिक प्रोटोकॉल 2 में प्रदान की गई है। गोल्डन गेट क्लोनिंग में एक इंसर्ट को समायोजित करने के लिए एक उदाहरण बेसिक प्रोटोकॉल 3 में प्रदान किया गया है, जो बताता है कि प्रवर्धन और क्लोनिंग के लिए प्राइमरों को कैसे डिज़ाइन किया जाए। गोल्डन गेट वेक्टर में रुचि के जीन की।

पारंपरिक क्लोनिंग विधियों का उपयोग करते हुए परिभाषित ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों और ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों के बाद के संयोजन को मल्टीजीन निर्माणों में बनाना कोई आसान काम नहीं है। यह न केवल डीएनए असेंबली के कारण है, बल्कि बड़े निर्माणों के लिए क्लोनिंग रणनीतियों को डिजाइन करने में कठिनाई के कारण भी है। इस सीमा का एक कारण यह है कि प्रत्येक क्लोनिंग चरण में उपयोग किए जाने वाले प्रतिबंध एंजाइमों के लिए मान्यता स्थल आमतौर पर बंधाव के बाद के निर्माणों में मौजूद होते हैं। इसलिए, प्रत्येक क्रमिक चरण के लिए अलग-अलग प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करना पड़ता है, बड़ी संख्या में जीन के साथ काम करते समय क्लोनिंग रणनीति की योजना बनाना बेहद कठिन या असंभव है। प्रत्येक क्लोनिंग चरण पर डीएनए असेंबली के लिए गोल्डन गेट क्लोनिंग के उपयोग के साथ संयुक्त, भागों और असेंबली रणनीति को मानकीकृत करके इस समस्या का समाधान प्रदान किया जाता है। यह रणनीति मॉड्यूलर क्लोनिंग सिस्टम MoClo (Engler et al।, 2014 Weber, Engler, Gruetzner, Werner, & Marillonnet, 2011 Werner, Engler, Weber, Gruetzner, & Marillonnet, 2012) द्वारा नियोजित है। MoClo प्रणाली मानक भागों के उपयोग पर आधारित है जो PCR द्वारा बनाए जाते हैं, एक वेक्टर बैकबोन में क्लोन किए जाते हैं, और अनुक्रमित होते हैं। मानक भागों में एक मूल आनुवंशिक तत्व का डीएनए अनुक्रम होता है, जैसे प्रमोटर, कोडिंग अनुक्रम, या टर्मिनेटर। बेसिक प्रोटोकॉल 4 एक चरण में पीसीआर उत्पादों से भागों की क्लोनिंग के लिए एक विधि प्रदान करता है (चित्र 1), और एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल दो क्रमिक चरणों में बड़े भागों को क्लोन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है। भागों की मानकीकृत संरचना उन्हें पीसीआर प्रवर्धन की आवश्यकता के बिना कई अलग-अलग निर्माणों में पुन: उपयोग करने की अनुमति देती है। यह विधानसभा प्रक्रिया के मानकीकरण की भी अनुमति देता है। एक-पॉट असेंबली चरणों की एक श्रृंखला का उपयोग करके मूल भागों से मल्टीजीन निर्माणों को इकट्ठा किया जाता है। क्लोनिंग रणनीति और MoClo सिस्टम के साथ उपयोग किए जाने वाले विभिन्न क्लोनिंग चरणों को बेसिक प्रोटोकॉल 5 में वर्णित किया गया है।

1: एक विशिष्ट गोल्डन गेट क्लोनिंग प्रतिक्रिया करना

गोल्डन गेट क्लोनिंग के सिद्धांत में एक प्रकार के आईआईएस प्रतिबंध एंजाइम और लिगेज का उपयोग प्रतिबंध-बंधाव में एक एकल चरण में एक वेक्टर में परिभाषित रैखिक क्रम में कई डीएनए टुकड़े इकट्ठा करने के लिए होता है (चित्र 2 ए)। टाइप IIS प्रतिबंध एंजाइम अपने डीएनए पहचान साइट अनुक्रम के बाहर डीएनए को साफ करते हैं। उदाहरण के लिए, प्रतिबंध साइट बीएसएमैं (जीजीटीसीटीसी एन एन1एन2एन3एन4) में एक डीएनए रिकग्निशन साइट सीक्वेंस (जीजीटीसीटीसी) और एक डीएनए क्लीवेज साइट (↓) शामिल है जो 4-एनटी सिंगल-स्ट्रैंडेड डीएनए ओवरहांग (एन) की ओर जाता है।1एन2एन3एन4) पाचन के बाद। गोल्डन गेट क्लोनिंग के लिए उपयुक्त होने के लिए, सभी डीएनए अंशों को एक प्रकार के आईआईएस प्रतिबंध एंजाइम के लिए प्रतिबंध साइटों द्वारा फ़्लैंक किया जाना चाहिए, एक आवक अभिविन्यास के साथ जैसे कि डीएनए मान्यता साइट अनुक्रम पाचन चरण (छवि 2 बी) के दौरान डीएनए टुकड़ों से साफ हो जाते हैं। . गंतव्य वेक्टर में एक ही प्रकार के IIS एंजाइम के लिए दो प्रतिबंध स्थल भी होने चाहिए, लेकिन एक बाहरी अभिविन्यास के साथ जैसे कि डीएनए मान्यता साइटों को भी पाचन चरण द्वारा वेक्टर से साफ किया जाता है। अंत में, डीएनए अंशों के सिरों पर सभी एकल-फंसे 4-एनटी ओवरहैंग (जिसे फ्यूजन साइट भी कहा जाता है) और वेक्टर अद्वितीय और पूरक होना चाहिए ताकि अगले टुकड़े या वेक्टर के अंत तक एनीलिंग की अनुमति मिल सके। चूँकि अपेक्षित वृत्ताकार पुनः संयोजक डीएनए अणु में प्रयुक्त एंजाइम के लिए प्रतिबंध स्थल नहीं होते हैं, इसलिए इसे फिर से पचाया नहीं जा सकता है, जिससे प्रतिबंध और बंधाव एक ही प्रतिक्रिया मिश्रण में किया जा सकता है। यह डीएनए अंशों को उनके प्रारंभिक प्लास्मिड रीढ़ की हड्डी में वापस लिगेट करने की अनुमति देता है, जब तक कि वे अंततः वांछित पुनः संयोजक उत्पाद (छवि 2C) में शामिल नहीं हो जाते, पाचन और बंधन के अधिक चक्रों के अधीन हो जाते हैं। यह एक वेक्टर से दूसरे में एक टुकड़े के हस्तांतरण के लिए उपयोगी है, लेकिन यह तेजी से महत्वपूर्ण है जब एक ही चरण में कई टुकड़ों को क्लोन करने की आवश्यकता होती है। इसका कारण यह है कि बंधाव मिश्रण में प्लास्मिड की संख्या के साथ संभावित बंधाव घटनाओं की संख्या तेजी से बढ़ जाती है, जबकि एक चरण में सही ढंग से लिगेट किए गए उत्पाद प्राप्त करने की संभावना तेजी से कम हो जाती है (चित्र 2डी)। प्रतिबंध-बंधाव एक उच्च क्लोनिंग दक्षता की ओर जाता है और एक एकल क्लोनिंग प्रतिक्रिया (पोटापोव एट अल।, 2018) में 24 टुकड़ों को लिगेट करने की अनुमति देता है।

उपयोग किए गए डीएनए टुकड़े पीसीआर द्वारा प्राप्त रैखिक टुकड़े हो सकते हैं, लेकिन एक गोलाकार प्लास्मिड में क्लोन किए गए अनुक्रम भी हो सकते हैं। यह प्रोटोकॉल बताता है कि जब डीएनए भाग और गंतव्य वेक्टर दोनों प्लास्मिड के रूप में उपलब्ध हों तो गोल्डन गेट क्लोनिंग प्रतिक्रिया कैसे करें।

सामग्री

  • शुद्ध प्लास्मिड डीएनए:
    • गोल्डन गेट डेस्टिनेशन वेक्टर (बेसिक प्रोटोकॉल 2 देखें या एडजीन या अन्य शोधकर्ताओं से उपलब्ध)
    • सम्मिलित करता है (प्लाज्मिड डीएनए)
    • 10 यू / μl बीएसएमैं (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स, कैट नं। R0535L)
    • 10 यू / μl बीपीआईमैं (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैट नं। ER1012)
    • 10 यू / μl बीएसएमबीआई (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स, कैट नं। R0580s)
    • स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (जैसे, नैनोड्रॉप 1000, पेक्लैब)
    • 0.2-एमएल पीसीआर प्लेट्स (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैट नं। AB0600)
    • चिपकने वाला पीसीआर प्लेट सील (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैट नं। AB0588)
    • थर्मल साइक्लर (जैसे, C1000 टच, बायोरेड)
    • 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब
    • 37° और 42°C ब्लॉक इन्क्यूबेटर (उदा., Eppendorf ThermoMixer)
    • 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर और शेकर इनक्यूबेटर
    • कल्चर फ्लास्क या ट्यूब
    • डीएनए विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, वेक्टर एनटीआई, थर्मो फिशर साइंटिफिक)

    ध्यान दें: आईआईएस एंजाइम टाइप करें जो क्लेवाज पर 3-एनटी ओवरहैंग उत्पन्न करते हैं, जैसे कि LguI (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैट नं। ER1931), का भी उपयोग किया जा सकता है।

    प्रतिबंध-बंधन करें

    1. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डालने और वेक्टर प्लास्मिड के डीएनए एकाग्रता को मापें।

    2. प्रतिक्रिया मिश्रण में प्रत्येक डालने और वेक्टर की समान मात्रा जोड़ें। इस प्रकार 15 या 25 μl की कुल प्रतिक्रिया मात्रा में प्रत्येक प्लाज्मिड के 20 fmol का प्रयोग करें:

    • एक्स1 μl वेक्टर डीएनए
    • एक्स2 μl डालें 1
    • एक्स3 μl डालें 2
    • एक्स4 μl डालें 3
    • 1.0 μl टी 4 डीएनए लिगेज
    • 0.5 μl प्रकार आईआईएस एंजाइम
    • 1.5 μl 10 × बंधन बफर
    • एच2ओ से 15 μl
    • एक्स1 μl वेक्टर
    • एक्स2 μl डालें 1
    • एक्स3 μl डालें 2
    • … …
    • एक्सएन μl डालें एन
    • १.५ μl टी ४ डीएनए लिगेज
    • 1.0 μl प्रकार आईआईएस एंजाइम
    • 2.5 μl 10 × बंधन बफर
    • एच2ओ से 25 μl

    प्रत्येक डीएनए प्लाज्मिड की मात्रा की गणना सूत्र द्वारा की जाती है: 20 (fmol) × आकार (bp)/एकाग्रता (ng/µl)/1520। यदि सटीक पाइपिंग (<0.3 μl) के लिए गणना की गई मात्रा बहुत कम है, तो प्लास्मिड को पानी में 10 गुना पतला किया जाना चाहिए, और इस कमजोर पड़ने से 10 गुना बड़ी मात्रा में जोड़ा जाना चाहिए।

    3. निम्नलिखित शर्तों के साथ मिश्रण को थर्मल साइक्लर में इनक्यूबेट करें:

    • 50 चक्र: 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 16 डिग्री सेल्सियस
    • ५ मिनट के लिए ५० डिग्री सेल्सियस
    • १० मिनट के लिए ८० डिग्री सेल्सियस
    • 16°C

    जब BsaI का उपयोग किया जाता है, तो अंतिम 5-मिनट का पाचन चरण 50°C पर किया जाता है, क्योंकि BsaI 37°C और 50°C दोनों पर पच सकता है। इसके विपरीत, जब बीपीआईआई का उपयोग किया जाता है, तो अंतिम पाचन चरण अभी भी 37 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है, क्योंकि यह इस एंजाइम के लिए इष्टतम पाचन तापमान है।

    उत्पाद को ई. कोलाई में बदलना

    4. पूरे बंधाव मिश्रण (15 या 25 μl) को ५० μl सक्षम . में जोड़ें ई कोलाई कोशिकाओं और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।

    5. 90 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर हीट शॉक। कोशिकाओं को 2 मिनट के लिए बर्फ पर ठीक होने दें।

    6. थर्मोमिक्सर में ५०० μl पौंड या समाज माध्यम जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए कोशिकाओं को हिलाएं।

    7. उपयुक्त एंटीबायोटिक और X-gal युक्त LB प्लेटों पर प्लेट। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं ।

    एक से तीन आवेषण के साथ प्रतिरूपण प्रतिक्रियाओं के लिए, प्लेट 10-20 μl। इंसर्ट की संख्या बढ़ाने के लिए प्लेट बड़ी मात्रा में लें, क्योंकि प्राप्त कॉलोनियों की संख्या कम होगी। उदाहरण के लिए, तीन से अधिक टुकड़ों वाले निर्माणों के लिए प्लेट 50 μl या अधिक।

    कॉलोनियों को चुनें और क्लोनों का आकलन करें

    8. अलग-अलग कॉलोनियों को चुनें और 5 मिली एलबी माध्यम का टीका लगाएं। एक प्रकार के बरतन मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं ।

    गोल्डन गेट क्लोनिंग वैक्टर में आमतौर पर ब्लू-व्हाइट स्क्रीनिंग के लिए एक लैकज़ टुकड़ा होता है (एक कैरोटेनॉइड बायोसिंथेसिस ऑपेरॉन को कभी-कभी लाल-सफेद स्क्रीनिंग के लिए एक मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है)। सफेद कॉलोनियों को चुना जाता है। क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं के लिए जिन्हें टुकड़ों की तैयारी के लिए पीसीआर की आवश्यकता नहीं थी, दो कॉलोनियों को चुनना आम तौर पर पर्याप्त होता है। पीसीआर द्वारा प्रवर्धित अंशों से किए गए क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं के लिए, दो से अधिक क्लोनों को एक को खोजने की आवश्यकता हो सकती है जिसमें कोई पीसीआर-प्रेरित उत्परिवर्तन नहीं होता है।

    9. एक मिनीप्रेप किट का उपयोग करके डीएनए तैयार करें, ५० μl की मात्रा में eluting।

    10. एक उपयुक्त एंजाइम का उपयोग करके 10-μl प्रतिक्रिया में 1 μl eluate को डाइजेस्ट करें (अक्सर बीएसएमैं या बीपीआईमैं MoClo सिस्टम का उपयोग करते समय मूल प्रोटोकॉल 4 देखता हूं) डीएनए फिंगरप्रिंटिंग द्वारा सही असेंबली की पुष्टि करने के लिए।

    11. यदि डीएनए टुकड़े तैयार करने के लिए पीसीआर प्रवर्धन का उपयोग किया गया था, तो प्लास्मिड को अनुक्रमित करें।

    2: गोल्डन गेट क्लोनिंग के लिए एक वेक्टर को समायोजित करना

    गोल्डन गेट क्लोनिंग के लिए आवश्यक है कि डीएनए टुकड़े और प्राप्तकर्ता वेक्टर विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुरूप हों, जैसे कि टुकड़ों और वेक्टर के सिरों पर टाइप IIS एंजाइम प्रतिबंध साइटों की उपस्थिति, और टुकड़ों के आंतरिक अनुक्रमों में समान प्रतिबंध साइटों की कमी और वेक्टर। गोल्डन गेट क्लोनिंग के लिए उपयुक्त कई वैक्टर कई शोध समूहों से उपलब्ध हैं, और उपलब्ध वैक्टरों की संख्या भविष्य में बढ़ने की संभावना है। फिर भी, एक मानक क्लोनिंग वेक्टर को गोल्डन गेट क्लोनिंग वेक्टर में परिवर्तित करना कभी-कभी उपयोगकर्ता की विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए आवश्यक होता है। ऐसा करने के लिए कई रणनीतियाँ हैं, जिसमें गिब्सन डीएनए असेंबली या गोल्डन गेट क्लोनिंग का उपयोग करना शामिल है।

    गोल्डन गेट क्लोनिंग के साथ प्रयोग के लिए पीईटी-28बी (+) वेक्टर को परिवर्तित करने के लिए यहां एक उदाहरण दिया गया है। इस उदाहरण में, ए लैक्ज़ अल्फा खंड दो से घिरा हुआ है बीएसएमल्टीक्लोनिंग साइट (छवि 3 ए) की जगह, I साइटों को वेक्टर में डाला गया है। NS लैक्ज़ बाद में ब्लू-व्हाइट स्क्रीनिंग के लिए टुकड़े का उपयोग किया जाएगा। यहाँ, दो संलयन स्थल लैक्ज़ फ्रैगमेंट एएटीजी और जीसीटीटी हैं, जो कोडिंग सीक्वेंस के क्लोनिंग के लिए MoClo मानक के अनुरूप हैं (बेसिक प्रोटोकॉल 4 देखें)। हालांकि, वे किसी भी अन्य अनुक्रम हो सकते हैं जो उपयोगकर्ता चाहते हैं, जब तक कि वे एक-दूसरे से अलग हों और गैर-पैलिंड्रोमिक हों। वास्तव में, पैलिंड्रोमिक अनुक्रमों से युक्त ओवरहैंग अन्य अभिविन्यास में उसी टुकड़े की एक अतिरिक्त प्रतिलिपि के समान ओवरहांग की घोषणा कर सकते हैं, जिससे स्थिर बंधाव उत्पाद हो सकते हैं जो फिर भी गलत हैं और जिसके परिणामस्वरूप क्लोनिंग दक्षता में उल्लेखनीय कमी आई है। यहां दिए गए उदाहरण में, एटीजी जो कि पहली फ्यूजन साइट का हिस्सा है, एक मेथियोनीन स्टार्ट कोडन से मेल खाती है, जिसे अपस्ट्रीम वेक्टर अनुक्रमों में मौजूद हिज टैग के साथ फ्रेम में क्लोन किया जाता है। वेक्टर और लैक्ज़ टुकड़ा पीसीआर द्वारा प्राप्त किया जाता है, और दूसरे प्रकार के आईआईएस एंजाइम का उपयोग करके असेंबली की जाती है, बीपीआईI. चूंकि चार हैं बीपीआईमैं वेक्टर में स्थित हूं, उन्हें डीएनए मान्यता अनुक्रमों में एकल-न्यूक्लियोटाइड म्यूटेशन डालने के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमरों का उपयोग करके हटा दिया जाता है।

    अतिरिक्त सामग्री (मूल प्रोटोकॉल 1 भी देखें)

    • वाणिज्यिक विक्रेता से जीन-विशिष्ट प्राइमर (जैसे, यूरोफिन्स जीनोमिक्स)
    • के प्रवर्धन के लिए प्लास्मिड टेम्पलेट लैक्ज़ कैसेट (जैसे, pUC19, न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स, कैट नं। N3041S)
    • वेक्टर प्लास्मिड डीएनए (जैसे, PET-28b (+), नोवागेन, मर्क मिलिपोर, कैट। नंबर 69418)
    • हाई-फिडेलिटी पीसीआर एम्प्लीफिकेशन किट (जैसे, केओडी हॉट स्टार्ट डीएनए पोलीमरेज़, मिलिपोर सिग्मा, वीडब्ल्यूआर, कैट नं। 71086-3)
    • पीसीआर टुकड़ा शुद्धिकरण किट (जैसे, न्यूक्लियोस्पिन जेल और पीसीआर क्लीन-अप, माचेरी नागेल, कैट नं। 740609.250)

    1. प्राइमरों को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन करें लैक्ज़ टुकड़ा।

    इस उदाहरण के लिए प्राइमरी स्थानों और अनुक्रमों को चित्र 3 में दिखाया गया है। पहले दो प्राइमर, पीआर1 और पीआर2, को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। लैक्ज़ pUC19 से टुकड़ा। pUC19 को एक टेम्पलेट के रूप में चुना गया है क्योंकि इसमें प्राप्तकर्ता वेक्टर (Kan R) से एक अलग एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन (Amp R) है। यह परिवर्तन के बाद क्लोन की जांच करते समय अपचित टेम्पलेट वेक्टर के कैरीओवर द्वारा गलत निर्माण प्राप्त करने की संभावना को कम करता है। प्रवर्धित टुकड़े में के लिए एक कार्यात्मक इकाई होती है लैक्ज़ ब्लू-व्हाइट स्क्रीनिंग के लिए मार्कर। प्राइमर Pr1 और Pr2 में है बीपीआईI प्रतिबंध साइटें (अंजीर 3B में gaagac) 4-nt फ्यूजन साइटों के साथ क्रमशः AATG और GCTT अनुक्रमों के अनुरूप हैं। दो प्राइमरों में संलयन स्थलों का अनुसरण किया जाता है बीएसएमैं विपरीत अभिविन्यास में साइटों को प्रतिबंधित करता हूं (चित्र 3बी में ggtctc = ggacc का उल्टा पूरक)। NS बीएसएI साइटें परिणामी वेक्टर का हिस्सा बन जाएंगी और वेक्टर बनने के बाद गोल्डन गेट क्लोनिंग के लिए उपयोग की जाएंगी।

    PET-28b वेक्टर में चार होते हैं बीपीआईमैं आंतरिक अनुक्रमों में साइटों को प्रतिबंधित करता हूं, जिन्हें एकल-न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन (एक प्रक्रिया जिसे पालतू बनाना कहा जाता है) बनाकर हटाने की आवश्यकता होती है। इस उद्देश्य के लिए आठ प्राइमरों की आवश्यकता होती है (Pr3 और Pr6-14)। कोडिंग अनुक्रमों में स्थित प्रतिबंध साइटों के लिए मौन उत्परिवर्तन किए जाते हैं (इस मामले में, लैक I रिप्रेसर, जिसमें दो होते हैं बीपीआईआई साइट्स)। प्राइमरों की एक अंतिम जोड़ी (Pr4 और Pr5) 2 kb से बड़े टुकड़ों को बढ़ाने से बचने के लिए बनाई गई है, प्राइमर की यह जोड़ी वैकल्पिक है। प्राइमर्स Pr3-14 सभी में a . होता है बीपीआईमैं एक फ्यूजन साइट के साथ साइट करता हूं जिसे उस टुकड़े के फ्यूजन साइट के साथ संगत होने के लिए चुना जाता है जिससे इसे लिगेट किया जाएगा।

    आदेश देते समय, न्यूनतम शुद्धि (नमक मुक्त) के साथ न्यूनतम संभव राशि (यानी, 0.01 µmol) प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है।

    1. एक टेम्पलेट के रूप में pUC19 का उपयोग करके प्राइमर जोड़ी Pr1-2 के साथ एक 50-μl पीसीआर प्रतिक्रिया सेट करें।
    2. एक टेम्पलेट के रूप में पीईटी-28b (+) का उपयोग करके प्राइमर जोड़े Pr3-4 से Pr13-14 तक छह 50-μl प्रतिक्रियाओं को सेट करें।

    3. पीसीआर सफल रहा था या नहीं यह देखने के लिए जेल पर प्रत्येक प्रतिक्रिया से 5 μl चलाएं।

    4. एक स्तंभ-आधारित किट (यानी, माचेरी नागेल न्यूक्लियोस्पिन डीएनए क्लीन-अप किट) का उपयोग करके प्रत्येक प्रतिक्रिया से शेष 45 μl को शुद्ध करें।

    यह पीसीआर उत्पाद को किसी भी शेष डीएनए पोलीमरेज़ और डीएनटीपी से अलग करेगा, साथ ही प्राइमर डिमर जो अधिकांश पीसीआर प्रतिक्रियाओं में विभिन्न स्तरों पर उत्पन्न होते हैं।

    5. एक नैनोड्रॉप जैसे स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके शुद्ध पीसीआर उत्पादों की मात्रा निर्धारित करें।

    6. एंजाइम का उपयोग करके गोल्डन गेट क्लोनिंग रिएक्शन (बेसिक प्रोटोकॉल 1 देखें) करें बीपीआईI. उत्पाद को में बदलना ई कोलाई (बेसिक प्रोटोकॉल 1 देखें) और नीली कॉलोनियों का चयन करें।

    इस विशेष उदाहरण में, ट्रांसफॉर्मेंट्स को केनामाइसिन और एक्स-गैल युक्त एलबी पर चढ़ाया जाना चाहिए। सही कॉलोनियां सफेद नहीं, बल्कि नीली होनी चाहिए।

    7. एक मिनीप्रेप किट का उपयोग करके डीएनए तैयार करें।

    8. डाइजेस्ट 1 μl साथ बीएसएमैं एक 10-μl प्रतिक्रिया में।

    इस विशेष निर्माण के लिए 5.3 kb और 506 bp के दो टुकड़े अपेक्षित हैं।

    प्लास्मिड के भीतर विभिन्न पदों पर डिजाइन किए गए प्राइमरों के साथ पूरे प्लास्मिड को अनुक्रमित करना वांछनीय है क्योंकि पीसीआर का उपयोग पूरे वेक्टर के प्रवर्धन के लिए किया गया था। हालांकि, चूंकि लैक्ज़ मार्कर की प्रतिकृति या अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक कुछ क्षेत्रों को क्रियाशील होना चाहिए, यदि प्लास्मिड प्रतिकृति करता है और कॉलोनियां नीली हैं, तो पूरे प्लास्मिड को अनुक्रमित करने की आवश्यकता नहीं हो सकती है। कम से कम, जीन की अभिव्यक्ति के लिए बाद में आवश्यक सभी तत्वों को अनुक्रमित किया जाना चाहिए, जिसमें T7 प्रमोटर से टर्मिनेटर तक का क्षेत्र शामिल है। दो शुरू की गई बीएसएआई साइटों वाले क्षेत्र की अनुक्रमण यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि दो संलयन साइटों का क्रम अपेक्षित है।

    क्लोनिंग वेक्टर का उपयोग अब गोल्डन गेट क्लोनिंग के लिए किया जा सकता है।

    3: गोल्डन गेट क्लोनिंग के लिए एक इंसर्ट को समायोजित करना

    यह प्रोटोकॉल बताता है कि गोल्डन गेट क्लोनिंग में रुचि के अनुक्रम को समायोजित करने के लिए प्राइमरों को कैसे डिज़ाइन किया जाए और फिर गोल्डन गेट गंतव्य वेक्टर में प्रवर्धित अंशों को क्लोन किया जाए। a के कोडिंग अनुक्रम की क्लोनिंग के लिए एक उदाहरण दिया गया है अरबीडोफिसिस थालीआना isoflavone reductase an . से प्रवर्धित अरबीडॉप्सिस सीडीएनए टेम्पलेट (जेनबैंक परिग्रहण NM_106183)।

    अतिरिक्त सामग्री (मूल प्रोटोकॉल 1 और 2 भी देखें)

    • पीसीआर के लिए सीडीएनए या डीएनए टेम्पलेट (यहां, सीडीएनए से अरबीडॉप्सिस)
    • गोल्डन गेट गंतव्य वेक्टर का प्लास्मिड डीएनए

    1. ब्याज के अनुक्रम के खुले पठन फ्रेम में मूक उत्परिवर्तन डिजाइन करें सिलिको में क्लोनिंग सॉफ्टवेयर (जैसे, वेक्टर एनटीआई) का उपयोग करना।

    इस उदाहरण में, कोडिंग अनुक्रम में एक होता है बीएसएमैं साइट (छवि 4 ए)। इसे एकल-न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन द्वारा सिलिको में हटा दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक मूक उत्परिवर्तन होता है (चित्र 4बी में लाल रंग में दिखाया गया है)।

    2. वेक्टर के साथ संगतता के लिए कोडिंग अनुक्रम में दो फ़्लैंकिंग फ़्यूज़न साइट जोड़ें।

    इस मामले में, एएटीजी देने के लिए प्रारंभ कोडन से पहले एक ए जोड़ें, और स्टॉप कोडन के बाद जीसीटीटी जोड़ें।

    जोड़ा अनुक्रम चित्र 4खमें लाल रंग में दिखाया गया है, और संलयन साइटों को नीले रंग में दिखाया गया है।

    3. उत्परिवर्तन के स्थल पर एक संलयन स्थल का चयन करें।

    दो पीसीआर अंशों को प्रवर्धित किया जाएगा, एक उत्परिवर्तन के प्रत्येक पक्ष पर (चित्र 4ए में I और FR), और फिर एक संलयन साइट के माध्यम से इकट्ठा किया जाता है जो उत्परिवर्तित न्यूक्लियोटाइड के पास या ओवरलैप होता है। फ्यूजन साइट को अन्य फ्यूजन साइट्स (एएटीजी और जीसीटीटी) से अलग होना चाहिए और पैलिंड्रोमिक नहीं होना चाहिए। इसमें कम से कम एक G या C (अधिक, यदि संभव हो तो) होना चाहिए, क्योंकि केवल As या T वाली साइटें डीएनए असेंबली (पोटापोव एट अल।, 2018) के लिए कम अच्छी तरह से काम कर सकती हैं। जब कई फ्यूजन साइटों की आवश्यकता होती है, तो सभी साइटों की उपयुक्तता की जांच के लिए लिगेज फिडेलिटी व्यूअर प्रोग्राम (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स, http://ggtools.neb.com/viewset/run.cgi) का उपयोग किया जा सकता है। वर्तमान उदाहरण में, एक एकल अनुक्रम, GGAC, का चयन किया गया है (चित्र 4B में पीले रंग में दिखाया गया है)।

    4. सभी फ्यूजन साइटों से शुरू होने वाले प्राइमर डिजाइन करें। प्रत्येक उत्परिवर्तित साइट के लिए विपरीत दिशा में दो प्राइमरों का चयन करें (इस मामले में, केवल एक साइट)। पीसीआर प्रवर्धन के लिए उपयुक्त पिघलने का तापमान देने के लिए प्राइमरों को काफी लंबा बनाएं।

    5. का क्रम जोड़ें बीएसएमैं सभी प्राइमरों की शुरुआत में साइट (tt ggtctc a) को पहचानता हूं।

    प्राइमरों की अंतिम सूची चित्र 4गमें दिखाई गई है ।

    6. उपयुक्त प्राइमर जोड़े (Isof1-2 और Isof3-4 Fig. 4A) का उपयोग करके दो PCR अंशों को प्रवर्धित करें। अरबीडॉप्सिस एक ५०-μl प्रतिक्रिया में सीडीएनए टेम्पलेट। सही टुकड़ा प्रवर्धित किया गया था कि जाँच करने के लिए एक जेल पर 5 μl चलाएँ। निर्माता के निर्देशों के अनुसार कॉलम-आधारित किट का उपयोग करके शेष 45 μl को शुद्ध करें।

    7. सेट अप करें और बताए अनुसार असेंबली रिएक्शन करें (बेसिक प्रोटोकॉल 1 देखें)।

    क्योंकि यह उदाहरण वेक्टर में क्लोन किए गए केवल दो टुकड़ों के साथ एक साधारण क्लोनिंग का वर्णन करता है, 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक साधारण ऊष्मायन, 5 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस और 10 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर्याप्त होना चाहिए।

    8. बंधाव मिश्रण को सक्षम में बदलना ई कोलाई, केनामाइसिन और एक्स-गैल युक्त एलबी पर प्लेट, और परिणामी कॉलोनियों को स्क्रीन करें।

    मिनिप्रेप्स को दो एंजाइमों के साथ पचा लिया जाता है, जिसमें इंसर्ट को फ़्लैंक करने वाली प्रतिबंध साइटें होती हैं, या ऐसे एंजाइम होते हैं जिनमें वेक्टर में साइट होती है। चूंकि पीसीआर का उपयोग क्लोनिंग के लिए किया गया था, इसलिए क्लोन किए गए इंसर्ट को इंसर्ट को फ्लैंक करने वाले वेक्टर में अनुक्रमों के लिए प्राइमरों का उपयोग करके अनुक्रमित किया जाना चाहिए।

    4: स्तर 0 वैक्टर का उपयोग करके पदानुक्रमित मॉड्यूलर क्लोनिंग (MoClo) के साथ संगत छोटे मानक भागों को उत्पन्न करना

    गोल्डन गेट क्लोनिंग का उपयोग करके प्लास्मिड से डीएनए अंशों का संयोजन जल्दी और कुशलता से किया जा सकता है। इसके विपरीत, पीसीआर उत्पादों से असेंबली में अधिक काम करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि पीसीआर उत्पादों में अक्सर पीसीआर प्रवर्धन के दौरान प्राइमरों की गलत-एनीलिंग द्वारा गठित प्राइमर डिमर होते हैं। क्योंकि प्राइमर डिमर एक ही प्रकार के आईआईएस प्रतिबंध साइटों द्वारा पीसीआर उत्पादों के रूप में फ़्लैंक किए जाते हैं, उन्हें क्लोन किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप गलत निर्माण और क्लोनिंग दक्षता कम हो जाती है (चित्र 5)। यहां तक ​​कि अगर कोई प्राइमर डिमर नहीं बनाया जाता है, तो क्लोन किए गए निर्माणों को यह सुनिश्चित करने के लिए अनुक्रमित करने की आवश्यकता होती है कि उनमें पीसीआर-प्रेरित उत्परिवर्तन न हों। इसलिए, यह एक ऐसी प्रणाली के लिए बहुत मायने रखता है जहां क्लोन और अनुक्रमित डीएनए भागों को विभिन्न निर्माणों में पुन: उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, जिन भागों में नियामक अनुक्रम होते हैं जैसे प्रमोटर और टर्मिनेटर कई अलग-अलग निर्माणों में पुन: उपयोग किए जा सकते हैं।

    मॉड्यूलर क्लोनिंग सिस्टम MoClo को विभिन्न निर्माणों में क्लोन किए गए भागों के पुन: उपयोग की सुविधा के लिए डिज़ाइन किया गया था (चित्र 6)। यह मूल भागों के उपयोग पर आधारित है जिन्हें गोल्डन गेट क्लोनिंग का उपयोग करके एक साथ रखा गया है। बुनियादी भागों को स्तर 0 मॉड्यूल के रूप में क्लोन किया जाता है और ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों को बनाने के लिए स्तर 1 क्लोनिंग वैक्टर में इकट्ठा किया जाता है। स्तर 1 के निर्माणों को तब स्तर एम और पी मल्टीजीन निर्माण बनाने के लिए इकट्ठा किया जाता है। मूल भागों में दो द्वारा फ़्लैंक किए गए मूल आनुवंशिक तत्व का कोडिंग अनुक्रम होता है बीएसएमैं विपरीत अभिविन्यास में साइटों को प्रतिबंधित करता हूं (चित्र 7)। बुनियादी भागों के क्लोनिंग के लिए टेम्प्लेट के रूप में डीएनए या सीडीएनए से प्रवर्धन की आवश्यकता होती है। गोल्डन गेट क्लोनिंग का उपयोग करके प्रवर्धित उत्पाद को प्राप्तकर्ता वेक्टर में क्लोन किया जाता है। क्लोनिंग चरणों में भाग प्रकार, डिज़ाइन प्राइमरों को परिभाषित करना शामिल है बीएसएमैं टुकड़ों के सिरों पर साइटों को प्रतिबंधित करता हूं, आंतरिक अनुक्रमों से साइटों को हटाता हूं, और एक वेक्टर में प्रवर्धित टुकड़ों को क्लोन करता हूं।

    अतिरिक्त सामग्री (मूल प्रोटोकॉल 1 और 2 भी देखें)

    • पीसीआर के लिए सीडीएनए या डीएनए टेम्पलेट (यहां, सीडीएनए से अरबीडॉप्सिस)
    • यूनिवर्सल लेवल 0 क्लोनिंग वेक्टर pAGM9121 (Addgene, प्लाज्मिड #51833)

    1. स्तर 0 मॉड्यूल (भाग) के प्रकार को परिभाषित करें।

    भागों में प्रमोटर, कोडिंग सीक्वेंस के साथ या बिना स्टॉप कोडन, C- या N-टर्मिनल फ्यूजन टैग और टर्मिनेटर (चित्र 7A) शामिल हो सकते हैं। प्रत्येक भाग दो से घिरा हुआ है बीएसएI विपरीत अभिविन्यास में स्थित है (चित्र 7B)। के 4-बीपी अनुक्रम बीएसएआई क्लीवेज साइट्स (फ्यूजन साइट्स) प्रत्येक प्रकार के मॉड्यूल के लिए विशिष्ट होती हैं और परिभाषित करती हैं कि किन हिस्सों को एक साथ जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, 3′ फ्यूजन साइट (प्रो इन अंजीर। 7A) के रूप में TACT के साथ एक प्रमोटर मॉड्यूल को केवल 5′ छोर (छवि 7A में 5UTR2) पर समान फ्यूजन साइट के साथ एक अनट्रांसलेटेड लीडर सीक्वेंस से जोड़ा जा सकता है। प्रत्येक भाग प्रकार के लिए, संगत फ्यूजन साइटों के साथ एक विशिष्ट क्लोनिंग वेक्टर उपलब्ध है। वैकल्पिक रूप से, सभी भाग प्रकारों को इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में सार्वभौमिक स्तर 0 क्लोनिंग वेक्टर pAGM9121 (अंजीर। 7D और 8) में क्लोन किया जा सकता है। स्तर 0 मॉड्यूल कई बुनियादी भागों के कंपोजिट भी हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, एक पूर्ण ट्रांसक्रिप्शन इकाई वाले निर्माणों को फ्यूजन साइटों जीजीएजी और सीजीसीटी के बीच स्तर 0 मॉड्यूल के रूप में सीधे क्लोन किया जा सकता है। अन्य प्रकार के आनुवंशिक तत्व, जैसे कि फेज पुनर्संयोजन साइट या मैट्रिक्स अटैचमेंट क्षेत्र, को फ्यूजन साइट GGAG और CGCT के बीच स्तर 0 मॉड्यूल के रूप में भी क्लोन किया जा सकता है।

    2. जीन अनुक्रम में मौन उत्परिवर्तन का परिचय दें सिलिको में.

    MoClo सिस्टम के साथ उपयोग किए जाने वाले IIS एंजाइमों के लिए मूल भागों में प्रतिबंध साइट नहीं होनी चाहिए (बीएसएमैं, बीपीआईमैं, और वैकल्पिक रूप से बीएसएमबीआई)। एकल-न्यूक्लियोटाइड उत्परिवर्तन शुरू करके प्रतिबंध साइटों को हटा दिया जाता है, जिसे पहले किया जाता है सिलिको में. कोडिंग अनुक्रमों में आंतरिक साइटों को हटाना हमेशा मौन उत्परिवर्तन के साथ किया जा सकता है। प्रमोटर क्षेत्रों में अनुक्रमों को हटाना अधिक कठिन है, क्योंकि प्रमोटर फ़ंक्शन के लिए महत्वपूर्ण अनुक्रम हमेशा ज्ञात नहीं होते हैं। इसलिए, प्रमोटर अनुक्रमों को घरेलू बनाने के बाद, मेजबान जीव में प्रयोगात्मक रूप से मान्य करना आवश्यक होगा कि प्रमोटर अभी भी इरादा के अनुसार काम करता है। पालतू बनाना अरबीडॉप्सिस UGT78D2 जीन (जेनबैंक परिग्रहण NM_121711) यहां एक उदाहरण के रूप में प्रस्तुत किया गया है। इस जीन में एक होता है बीएसएमैं साइट, दो बीपीआईमैं साइटों, और एक बीएसएमबीआई साइट (चित्र। 9ए), जिसे चार मूक उत्परिवर्तन (चित्र 10 में लाल) पेश करके हटा दिया जाता है।

    3. भाग में दो मानक संलयन साइटें जोड़ें।

    क्योंकि यह मॉड्यूल एक स्टॉप कोडन (सीडीएस 1) के साथ एक कोडिंग अनुक्रम होगा, एएटीजी देने के लिए एक ए को प्रारंभ कोडन से पहले जोड़ा जाता है, और अनुक्रम जीसीटीटी स्टॉप कोडन के बाद जोड़ा जाता है (दोनों फ्यूजन साइटों को चित्र 10 में नीले रंग में हाइलाइट किया गया है) .

    4. सार्वभौमिक क्लोनिंग वेक्टर के साथ संगतता के लिए अनुक्रम जोड़ें।

    इस उदाहरण में, भाग को सार्वभौमिक स्तर 0 क्लोनिंग वेक्टर pAGM9121 में क्लोन किया जाएगा। इसलिए, सीटीसीए और सीजीएजी को आवश्यक संगतता प्रदान करने के लिए टुकड़े की शुरुआत और अंत में जोड़ा जाता है (चित्र 10 में हरे रंग में हाइलाइट किया गया)। ये सीक्वेंस बन जाएंगे बीएसएमैं उन साइटों को प्रतिबंधित करता हूं जो अंतिम स्तर 0 मॉड्यूल को फ़्लैंक करेंगे।

    5. गैर-मानक फ्यूजन साइटों का चयन करें जिनका उपयोग पीसीआर फ्रैगमेंट असेंबली के लिए किया जाएगा।

    ये 4-एनटी सीक्वेंस हैं जिनका उपयोग क्लोनिंग के दौरान पीसीआर उत्पादों को इकट्ठा करने के लिए किया जाएगा। उन्हें एक दूसरे से और फ्यूजन साइटों से अलग होने की आवश्यकता है जो वेक्टर (सार्वभौमिक क्लोनिंग वेक्टर के लिए CTCA और CTCG, या CDS1- विशिष्ट क्लोनिंग वेक्टर के लिए AATG और GCTT) में उपयोग किए जाएंगे। अनुपयुक्त फ्रैगमेंट लिगेशन से बचने के लिए उन्हें किसी भी चयनित फ्यूजन साइट के रिवर्स सप्लीमेंट से अलग होने की भी आवश्यकता है। चयनित अनुक्रम चित्र 10 में पीले रंग में हाइलाइट किए गए हैं।

    6. डिजाइन प्राइमर सभी फ्यूजन साइटों, मानक और गैर-मानक पर शुरू होते हैं।

    प्रतिबंध साइटों को हटाने के लिए उत्परिवर्तित साइटों पर फ्यूजन साइटों के लिए, प्राइमर दोनों ओरिएंटेशन में डिज़ाइन किए गए हैं। उपयुक्त पिघलने वाले तापमान के लिए प्राइमरों को काफी लंबा होना चाहिए। इसकी गणना ऑनलाइन उपलब्ध कई कार्यक्रमों में से किसी एक का उपयोग करके की जा सकती है या मैन्युअल रूप से की जा सकती है।

    7. IIS एंजाइम पहचान अनुक्रम प्रकार जोड़ें।

    चूंकि बीपीआईI का उपयोग असेंबली के लिए किया जाता है, अनुक्रम tt गागासी आ सभी प्राइमरों में जोड़ा जाता है। प्राइमर अनुक्रम और स्थान चित्र 9 में दिखाए गए हैं।

    8. पीसीआर अंशों को बढ़ाना।

    से पाँच अंशों को बढ़ाइए अरबीडॉप्सिस सीडीएनए अलग 50-μl प्रतिक्रियाओं में प्राइमर जोड़े Gtpr1-2 से Gtpr9-10 और एक प्रूफरीडिंग पोलीमरेज़ का उपयोग कर। प्रत्येक टुकड़ा अपेक्षित के रूप में प्रवर्धित किया गया था कि जाँच करने के लिए एक जेल पर 5 μl चलाएँ।

    9. कॉलम टुकड़ों को शुद्ध करता है।

    शेष पोलीमरेज़, प्राइमरों, और dNTPs को हटाने के लिए प्रवर्धित अंशों को शुद्ध करने की आवश्यकता होती है, और अधिकांश प्राइमर डिमर जो अक्सर प्रतिक्रिया में मौजूद होते हैं। यदि एक एकल टुकड़ा प्रवर्धित किया गया था, तो डीएनए शुद्धिकरण किट (जैसे, माचेरी नागेल डीएनए शुद्धि किट) का उपयोग करना पर्याप्त है। यदि कई डीएनए अंशों को प्रवर्धित किया गया तो सही आकार के पीसीआर अंशों का जेल निष्कर्षण आवश्यक हो सकता है।

    10. वर्णित के रूप में सार्वभौमिक स्तर 0 वेक्टर pAGM9121 में क्लोनिंग सेट करें (मूल प्रोटोकॉल 1 देखें)।

    11. में परिवर्तन ई कोलाई और दो सफेद कॉलोनियां चुनें। बाद में और कॉलोनियों को चुना जा सकता है यदि इन क्लोनों की अनुक्रमण सही क्रम नहीं दिखाता है।

    12. मिनीप्रेप डीएनए को पचाकर स्क्रीन कॉलोनियां बीएसएमैं।

    १३. वेक्टर प्राइमर लेव०सेक्फ और लेव०सेकर (चित्र ९बी) का उपयोग करके क्लोनों को अनुक्रमित करें।

    : स्तर -1 वैक्टर का उपयोग करके पदानुक्रमित मॉड्यूलर क्लोनिंग (MoClo) के साथ संगत बड़े मानक भागों का निर्माण

    जबकि छोटे भागों (<1.2 kb) को फ़्लैंकिंग वेक्टर अनुक्रमों में स्थित मानक प्राइमरों का उपयोग करके अनुक्रमित किया जा सकता है, बड़े भागों को पूरी तरह से वेक्टर प्राइमरों से अनुक्रमित नहीं किया जा सकता है। अतिरिक्त अनुक्रमण प्राइमरों को इसके मध्य भाग को अनुक्रमित करने के लिए भाग के भीतर डिज़ाइन किया जाना है। प्रत्येक भाग के लिए कस्टम अनुक्रमण प्राइमरों की आवश्यकता के बिना अनुक्रमण की सुविधा के लिए, एक वैकल्पिक रणनीति में क्लोनिंग पार्ट फ़्रैगमेंट (उप-भाग) होते हैं जो 1-1.2 kb से अधिक लंबे नहीं होते हैं, वेक्टर प्राइमरों का उपयोग करके उप-भागों को अनुक्रमित करते हैं, और फिर संयोजन करते हैं अंतिम स्तर 0 मॉड्यूल (छवि 11) बनाने के लिए दूसरी असेंबली प्रतिक्रिया का उपयोग करके अनुक्रमित उप-भाग। उप-भागों को एक सार्वभौमिक स्तर -1 क्लोनिंग वेक्टर (pAGM1311, चित्र 12) में क्लोन किया जाता है।

    अतिरिक्त सामग्री (मूल प्रोटोकॉल 4 भी देखें)

    1. भाग के प्रकार को परिभाषित करें, मौन उत्परिवर्तन का परिचय दें, मानक संलयन साइट जोड़ें, और वर्णित के रूप में सार्वभौमिक क्लोनिंग वेक्टर के साथ संगतता के लिए अनुक्रम जोड़ें (मूल प्रोटोकॉल 4, चरण 1-4) देखें।

    2. गैर-मानक फ्यूजन साइटों का चयन करें जिनका उपयोग पीसीआर फ्रैगमेंट असेंबली के लिए किया जाएगा।

    ये 4-एनटी सीक्वेंस हैं जिनका उपयोग क्लोनिंग के दौरान पीसीआर उत्पादों को इकट्ठा करने के लिए किया जाएगा। उन्हें एक दूसरे से और वेक्टर में उपयोग किए जाने वाले संलयन साइटों से अलग होने की आवश्यकता है (इस मामले में, सार्वभौमिक स्तर -1 वेक्टर के लिए एसीएटी और टीटीजीटी नीचे चरण 5 देखें)। अनुपयुक्त फ्रैगमेंट लिगेशन से बचने के लिए उन्हें किसी भी चयनित फ्यूजन साइट के रिवर्स सप्लीमेंट से अलग होने की भी आवश्यकता है। चयनित अनुक्रम बेसिक प्रोटोकॉल 4 (चित्र 10 में पीले रंग में हाइलाइट किए गए) के समान हैं।

    3. सभी फ्यूजन साइटों पर शुरू होने वाले डिजाइन प्राइमर, मानक और गैरमानक, जैसा कि वर्णित है (मूल प्रोटोकॉल 4, चरण 6 देखें)।

    4. IIS एंजाइम पहचान अनुक्रम प्रकार जोड़ें।

    स्तर -1 वैक्टर में क्लोनिंग के लिए, बीएसएI का उपयोग असेंबली के लिए किया जाता है, और इस प्रकार अनुक्रम tt जीजीटीसीटीसी a को सभी प्राइमरों के 5′ सिरे पर जोड़ा जाता है।

    5. सार्वभौमिक स्तर -1 क्लोनिंग वेक्टर के साथ संगतता के लिए अनुक्रम जोड़ें।

    यूनिवर्सल क्लोनिंग वेक्टर के दो फ्यूजन साइट एसीएटी और टीटीजीटी हैं, और उनमें ए . का हिस्सा होता है बीपीआईI प्रतिबंध साइट जो क्लोनिंग के बाद उप-भाग को फ़्लैंक करेगी (चित्र 12)। इसलिए, अनुक्रम एसीएटी और एसीए (टीटीजीटी के विपरीत पूरक) को दो प्राइमरों में जोड़ा जाना चाहिए जो पीसीआर टुकड़ों के समूह को एक साथ क्लोन किया जाएगा। इन अनुक्रमों को तुरंत 3′ में से जोड़ दिया जाता है बीएसएमैं साइट और सार्वभौमिक स्तर 0 वेक्टर फ्यूजन साइट (सीटीसीए या सीटीसीजी) से पहले। इस उदाहरण में, पहले तीन पीसीआर उत्पादों को सार्वभौमिक स्तर -1 वेक्टर पीएजीएम1311 में एक साथ क्लोन किया जाएगा, और चौथे और पांचवें उत्पादों को भी पीएजीएम1311 में एक साथ क्लोन किया जाएगा। पहले स्तर -1 निर्माण (जीटीपीआर1′ से 6′) और दूसरे स्तर -1 निर्माण (जीटीपीआर7′ से 10′) के लिए प्राइमर अनुक्रम और स्थान चित्र 11 में दिखाए गए हैं।

    6. पीसीआर उपयुक्त प्राइमर जोड़े (Gtpr1′-2′ से Gtpr9′-10′) का उपयोग करके टुकड़ों को बढ़ाना (बेसिक प्रोटोकॉल 4, चरण 8 देखें)।

    7. कॉलम अंशों को शुद्ध करें (मूल प्रोटोकॉल 4, चरण 9)।

    8. यूनिवर्सल लेवल -1 वेक्टर pAGM1311 का उपयोग करके वर्णित (बेसिक प्रोटोकॉल 1 देखें) के रूप में दो गोल्डन गेट क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं को सेट करें। पहले तीन उत्पादों को एक प्रतिक्रिया में और चौथे और पांचवें उत्पादों को दूसरी प्रतिक्रिया में क्लोन करें (चित्र -1 में स्तर -1 मॉड्यूल)।11ए)।

    9. में रूपांतरित करें ई कोलाई और दो सफेद कॉलोनियां चुनें। अधिक कॉलोनियों को बाद में चुना जा सकता है यदि इन क्लोनों की अनुक्रमण सही क्रम प्रदान नहीं करता है।

    10. मिनीप्रेप डीएनए को पचाकर स्क्रीन कॉलोनियां बीपीआईमैं।

    11. वेक्टर प्राइमरों Levm1seqF और Levm1seqR (चित्र 11B) का उपयोग करके अनुक्रम क्लोन।

    12. स्तर -1 उप-भागों से स्तर 0 मॉड्यूल को इकट्ठा करें। यूनिवर्सल लेवल 0 क्लोनिंग वेक्टर pAGM9121 (बेसिक प्रोटोकॉल 1 देखें) में दो चयनित स्तर -1 क्लोनों को इकट्ठा करने के लिए गोल्डन गेट क्लोनिंग रिएक्शन सेट करें।

    13. ट्रांसफॉर्म इन ई कोलाई कोशिकाएं।

    14. मिनीप्रेप डीएनए को पचाकर स्क्रीन कॉलोनियां बीएसएमैं।

    चूंकि इन निर्माणों को बनाने के लिए पीसीआर का उपयोग नहीं किया गया था, इसलिए अनुक्रमण की आवश्यकता नहीं है।

    5: स्तर 1, एम, और पी MoClo वैक्टर का उपयोग करके ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों और मल्टीजीन निर्माणों को इकट्ठा करना

    MoClo प्रणाली का उपयोग करते हुए बहुजीन निर्माणों का संयोजन श्रेणीबद्ध रूप से किया जाता है (चित्र 6)। पहला चरण स्तर 1 गंतव्य वैक्टर में स्तर 0 भागों की असेंबली है, जिसमें निर्माण करने के लिए आमतौर पर एक ट्रांसक्रिप्शन इकाई होती है। दूसरा मल्टीजीन निर्माणों का संयोजन है जो स्तर एम और पी वैक्टर का उपयोग करके वैकल्पिक चरणों में किया जाता है। एक स्तर एम मल्टीजीन निर्माण करने के लिए एक स्तर एम क्लोनिंग वेक्टर में छह ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों को इकट्ठा किया जा सकता है। फिर, छह स्तर तक एम निर्माणों को एक स्तर पी वेक्टर में इकट्ठा किया जा सकता है ताकि एक स्तर पी निर्माण 36 ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों तक हो सके। लेवल पी कंस्ट्रक्शन्स को और भी बड़े कंस्ट्रक्शन बनाने के लिए लेवल एम वैक्टर में खुद को असेंबल किया जा सकता है। इस प्रक्रिया को अनिश्चित काल तक दोहराया जा सकता है, जब तक कि प्लास्मिड के रूप में क्लोन किए जाने के लिए निर्माण बहुत बड़े नहीं हो जाते ई कोलाई. स्तर एम और पी विधानसभा उपयोग बीएसएमैं और बीपीआईमैं बारी-बारी से।

    अतिरिक्त सामग्री (मूल प्रोटोकॉल 1 भी देखें)

    • स्तर 0 भाग
    • MoClo टूलकिट से स्तर 1, M, और P गंतव्य वैक्टर (Addgene, किट #1000000044)

    स्तर 1 वैक्टर में ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों को इकट्ठा करें

    1. मानक स्तर 0 भागों का चयन करें।

    एक बहुजीन निर्माण की असेंबली की योजना बनाने के लिए पहला कदम प्रत्येक प्रतिलेखन इकाई के लिए आवश्यक सभी बुनियादी भागों की पहचान करना है। उदाहरण के लिए, चार ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों वाला एक निर्माण करने के लिए, प्रत्येक तीन भागों से बना है- जिसमें 5′-यूटीआर (प्रो + 5 यू), एक कोडिंग अनुक्रम (सीडीएस 1), और टर्मिनेटर (3 यू + के साथ एक 3′-यूटीआर) वाला प्रमोटर शामिल है। टेर)—कुल बारह भागों की आवश्यकता है।

    सभी भाग प्रकारों की एक सूची चित्र 7 में दिखाई गई है। जो भाग पहले से उपलब्ध नहीं हैं उन्हें वर्णित के अनुसार क्लोन किया गया है (मूल प्रोटोकॉल 4 देखें)। कुछ पहले से ही पौधों के लिए उपलब्ध हैं (MoClo प्लांट पार्ट्स किट, Addgene, किट #1000000047), क्लैमाइडोमोनास (https://www.chlamycollection.org/product/moclo-toolkit/ Crozet et al।, 2018), और सायनोबैक्टीरिया (http://www.addgene.org/browse/article/28196941/ वासुदेवन एट अल।, 2019) )

    2. स्तर 1 गंतव्य वैक्टर चुनें।

    चौदह स्तर 1 वैक्टर उपलब्ध हैं: सात अंतिम निर्माण में सात अलग-अलग स्थितियों में आगे की ओरिएंटेशन में एक ट्रांसक्रिप्शन यूनिट को क्लोन करने के लिए, और सात रिवर्स ओरिएंटेशन (छवि 13 ए) के लिए। सभी में दो हैं बीएसएस्तर 0 मॉड्यूल के साथ संगतता प्रदान करने के लिए I साइट्स और फ्यूजन साइट्स GGAG और CGCT। इनमें दो भी होते हैं बीपीआईमैं असेंबली के अगले चरण में इकट्ठे ट्रांसक्रिप्शन यूनिट के छांटने के लिए साइट करता हूं। NS बीपीआईI फ्यूजन साइटों को एक वेक्टर से दूसरे वेक्टर में संगतता प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। एक उदाहरण में जहां चार ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों को फॉरवर्ड ओरिएंटेशन में क्लोन किया जाता है, फॉरवर्ड ओरिएंटेशन (pL1F-1, pL1F-2, pL1F-3, और pL1F-4) के लिए स्थिति 1 से 4 के लिए वैक्टर चुने जाते हैं।

    NS बीपीआईवेक्टर 7 (टीजीसीसी) के अंत में आई फ्यूजन साइट वेक्टर 1 की शुरुआत में साइट के समान है, जिससे एक ही सात वैक्टर को अनिश्चित काल तक पुन: उपयोग करके एक मल्टीजीन निर्माण में सात से अधिक जीनों को क्लोन करने की अनुमति मिलती है। इस प्रकार, एक आठवीं प्रतिलेखन इकाई को वेक्टर 1 का उपयोग करके क्लोन किया जाता है, एक नौवीं ट्रांसक्रिप्शन इकाई को वेक्टर 2 का उपयोग करके क्लोन किया जाता है, और इसी तरह (चित्र 13C)।

    चित्र 13C में उदाहरण में, दो प्रतिलेखन इकाइयों को रिवर्स ओरिएंटेशन में क्लोन किया जाता है, और इसलिए रिवर्स ओरिएंटेशन में क्लोनिंग के लिए वैक्टर का चयन किया जाता है। एक ट्रांसक्रिप्शन यूनिट को एक ओरिएंटेशन में क्लोन किया जाना चाहिए या दूसरे का चुनाव पूरी तरह से उपयोगकर्ता की जरूरतों से तय होता है।

    3. स्तर 1 निर्माणों को इकट्ठा करें।

    चार गोल्डन गेट क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं का उपयोग करके निर्माणों को इकट्ठा किया जाता है, जिनमें से प्रत्येक में तीन चयनित मूल भाग और स्तर 1 वेक्टर होते हैं। पहली प्रतिलेखन इकाई के क्लोनिंग के लिए एक उदाहरण चित्र 14 में दिखाया गया है। क्लोनिंग प्रतिक्रिया वर्णित के रूप में की जाती है (मूल प्रोटोकॉल 1 देखें)। क्योंकि स्तर 1 के वैक्टर में a . होता है लैक्ज़ नीले-सफेद स्क्रीनिंग के लिए टुकड़ा, दो सफेद कॉलोनियों को चुना जाता है। जैसे-जैसे इकट्ठी ट्रांसक्रिप्शन इकाइयाँ द्वारा फ़्लैंक की जाती हैं बीपीआईमैं साइटों, मिनीप्रेप डीएनए की जाँच किसके द्वारा की जाती है बीपीआईमैं पाचन।


    बाँस के तलवों में मांसपेशियों का विकास हेटेरोमाइक्टेरिस जैपोनिकस लार्वा शाखात्मक उत्तोलक के विशेष संदर्भ में

    बाँस के तलवों में मांसपेशियों का विकास हेटेरोमाइक्टेरिस जैपोनिकस पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड, हाइड्रोजन पेरोक्साइड और ट्रिप्सिन के साथ एक बेहतर संपूर्ण माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला विधि का उपयोग करके, मुख्य रूप से कपाल की मांसपेशियों पर ध्यान केंद्रित करते हुए जांच की गई थी। के लार्वा एच. जपोनिकस शाखायुक्त उत्तोलक थे, लेकिन उन सभी को वयस्कों में नहीं रखा गया था, एक ऐसी स्थिति जो जापानी फ़्लाउंडर में भी देखी गई थी Paralichthys olivaceus. विशेष रूप से, लार्वा ब्रांचियल लेवेटर II और III विकास के दौरान गायब हो गए, जबकि I और IV लेवेटर इंटर्नस I और लेवेटर पोस्टीरियर बने रहे, जो वयस्कों में अच्छी तरह से परिभाषित मांसपेशियां थीं। एट्रोफाइड मांसपेशियों के स्थान पर, लेवटोरस एक्सटर्नी और लेवेटर इंटर्नस II ने ब्रांचियल मेहराब को विकसित और विनियमित किया। परिणामों से पता चला कि पृष्ठीय शाखाओं के मेहराब में मांसपेशियों की संरचना कायापलट से पहले वयस्क रूप में बदल जाती है एच. जैपोनिकस, जैसा इसमें दिखे पी. ओलिवेसियस, और यह परिवर्तन उस समूह के सभी सदस्यों के लिए सामान्य हो सकता है।


    १.१३: परिवर्तन - जीव विज्ञान

    इसका उत्तर यह है कि प्रेम 'बिना शर्त निःस्वार्थता' है, लेकिन यह एक ऐसा सत्य है जिसे हम तब तक सुरक्षित रूप से स्वीकार नहीं कर सकते जब तक हम मानव स्थिति की व्याख्या नहीं कर सकते - यह बताएं कि हमारा मानव व्यवहार अक्सर इतना प्रतिस्पर्धी, स्वार्थी और आक्रामक क्यों रहा है, इसलिए ऐसा प्रतीत नहीं होता है। यह इस प्रकार है कि 'प्यार क्या है' के सवाल के पीछे असली मुद्दा मानवीय स्थिति का मुद्दा रहा है।

    सबसे आश्चर्यजनक रूप से, हालांकि, जीव विज्ञान अब अंत में सपने में सामंजस्य स्थापित करने, छुड़ाने और इस प्रकार मनोवैज्ञानिक रूप से पुनर्वास, मानव-जाति-परिवर्तनकारी व्याख्या प्रदान करने में सक्षम है, जो हमारी प्रतीत होती है-अनदेखी मानव स्थिति की व्याख्या करता है, इस प्रकार हमें सुरक्षित रूप से यह स्वीकार करने की अनुमति देता है कि प्यार बिना शर्त निस्वार्थता है। (और यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि हमारी प्रजातियों की गहराई से मनोवैज्ञानिक रूप से परेशान स्थिति की यह व्याख्या मनोविकृति से बचने, तुच्छीकरण, मानव स्थिति का बेईमान खाता नहीं है जिसे जीवविज्ञानी ईओ विल्सन ने यूकोसियलिटी के अपने सिद्धांत में सामने रखा है, लेकिन मनोविकृति- संबोधित करना और हल करना, इसकी वास्तविक व्याख्या।)

    सभी महत्वपूर्ण, मनोवैज्ञानिक रूप से पुनर्वास, मानव-जाति-परिवर्तन, मानव स्थिति की वास्तविक व्याख्या प्रस्तुत करने से पहले, 'प्यार क्या है' का निम्नलिखित वैज्ञानिक उत्तर यह स्पष्ट करता है कि यह क्यों संभव नहीं है - अब तक - स्वीकार करने के लिए वह प्यार वास्तव में बिना शर्त निस्वार्थता है।

    दुनिया के महानतम भौतिकविदों, स्टीफन हॉकिंग और अल्बर्ट आइंस्टीन ने क्रमशः कहा है, कि 'अत्यधिक प्रभाव क्रम का है ... [में] ब्रह्मांड' ('द टाइम ऑफ हिज लाइफ', ग्रेगरी बेनफोर्ड, सिडनी मॉर्निंग हेराल्ड, 28 अप्रैल। 2002), और वह 'सब कुछ के पीछे एक आदेश है' (आइंस्टाइन रिवील्ड, पीबीएस, 1997)। हां, यह 'आदेश' हर जगह दिखाई देता है। युगों से एक अराजक ब्रह्मांड ने खुद को सितारों, ग्रहों और आकाशगंगाओं में व्यवस्थित किया। यहाँ पृथ्वी पर, परमाणुओं को अणु बनाने के लिए व्यवस्थित या एकीकृत किया गया → जो बदले में यौगिक बनाने के लिए एकीकृत हुए → वायरस जैसे जीव → एकल-कोशिका वाले जीव → बहुकोशिकीय जीव → और फिर बहुकोशिकीय जीवों के समाज। कुल मिलाकर, पृथ्वी पर जो हो रहा है वह यह है कि पदार्थ बड़े आकार में व्यवस्थित होता जा रहा है। तो जीवन का विषय या उद्देश्य या अर्थ पदार्थ का क्रम या एकीकरण या जटिलता है, एक प्रक्रिया जो नकारात्मक एन्ट्रॉपी के भौतिक नियम द्वारा संचालित होती है। 'होलिज़्म', जिसे डिक्शनरी ने 'प्रकृति में संपूर्ण बनाने की प्रवृत्ति' के रूप में परिभाषित किया है (संक्षिप्त ऑक्सफोर्ड डिक्शनरी, 5 वां संस्करण, 1964), और 'टेलोलॉजी', जिसे पीडीएफ संस्करण के पृष्ठ 34 में 'विश्वास उस उद्देश्य और' के रूप में परिभाषित किया गया है। डिजाइन प्रकृति का एक हिस्सा हैं' (मैक्वेरी डिक्शनरी, तीसरा संस्करण, 1998), दोनों ही ऐसे शब्द हैं जो इस एकीकृत 'प्रवृत्ति' को पहचानते हैं।

    पदार्थ के इस एकीकृत क्रम का एक महत्वपूर्ण हिस्सा निस्वार्थता है क्योंकि एक बड़े पूरे के लिए उस पूरे के हिस्सों को बनाने और धारण करने के लिए अपने स्वयं के कल्याण से ऊपर के कल्याण पर विचार करना चाहिए - सीधे शब्दों में कहें, स्वार्थ विभाजनकारी या विघटनकारी है जबकि निस्वार्थता एकीकृत है . तो दूसरों पर-अपना-अपना, परोपकारी, बिना शर्त स्वार्थ अस्तित्व का मूल विषय है। यह वह गोंद है जो दुनिया को एक साथ रखता है, और वास्तव में, 'प्रेम' शब्द से हमारा तात्पर्य है। वास्तव में, यदि हम धार्मिक शब्दावली पर विचार करें, तो प्रेम के लिए पुराना ईसाई शब्द 'कैरिटस' था, जिसका अर्थ है दान या देना या निस्वार्थता देखें कर्नल 3:14, 1 कुरिं। 13:1 - 13, 10:24, और यूहन्ना 15:13। बाइबल के इन सन्दर्भों में से, कुलुस्सियों ३:१४ प्रेम के एकीकृत महत्व को पूरी तरह से सारांशित करता है: 'और इन सभी गुणों के ऊपर प्रेम डाला जाता है, जो उन सभी को पूर्ण एकता में बांधता है।' यूहन्ना 15:13 में हम यह भी देखते हैं कि मसीह ने बिना शर्त जोर दिया 'प्रेम' शब्द का निःस्वार्थ महत्व जब उन्होंने कहा, 'इससे ​​बड़ा प्रेम कोई नहीं है, कि कोई अपने मित्रों के लिए अपने प्राण न्योछावर कर दे।'

    हालाँकि, इस उत्तर को स्वीकार करने और स्वीकार करने के साथ बड़ी समस्या यह है कि 'प्यार क्या है?' यह है कि इसने मनुष्यों को असहनीय रूप से निंदा करने के लिए बुरा, बुरा या अयोग्य के रूप में विभाजित प्रतिस्पर्धी, स्वार्थी और आक्रामक होने के लिए छोड़ दिया - वास्तव में, इतनी बेरहमी से प्रतिस्पर्धी होने के लिए , स्वार्थी और क्रूर कि मानव जीवन असहनीय हो गया है और हमने अपने ग्रह को लगभग नष्ट कर दिया है! प्यार और प्यारा होने की बात तो दूर, हमें लगता था कि हम प्यार नहीं करते और प्यार नहीं करते हैं, यही वजह है कि हमें यह समझाना पड़ा कि इंसानों के साथ आदर्श व्यवहार क्यों नहीं किया गया है - मानवीय स्थिति को कम नहीं समझाएं, जो सौभाग्य से अब हम कर सकते हैं - इससे पहले कि यह मनोवैज्ञानिक रूप से सुरक्षित हो। सामना करना, स्वीकार करना और स्वीकार करना कि 'प्यार का अर्थ क्या है' का उत्तर यह है कि यह एकीकृत और बिना शर्त निस्वार्थ होना है। वास्तव में, 'ईश्वर' की अवधारणा वास्तव में जीवन के एकीकृत, निस्वार्थ, प्रेमपूर्ण अर्थ की सच्चाई का हमारा व्यक्तित्व है, और यदि हम हॉकिंग और आइंस्टीन ने जो कहा है, उसे और शामिल करें तो हम देख सकते हैं कि वे दोनों सहमत हैं। हॉकिंग: 'भारी प्रभाव क्रम का है। जितना अधिक हम ब्रह्मांड के बारे में खोजते हैं, उतना ही हम पाते हैं कि यह तर्कसंगत कानूनों द्वारा शासित है। यदि कोई चाहे तो कह सकता है कि यह आदेश ईश्वर का कार्य था। आइंस्टीन ने ऐसा सोचा था ... हम भगवान के नाम से आदेश कह सकते हैं ('द टाइम ऑफ हिज लाइफ', ग्रेगरी बेनफोर्ड, सिडनी मॉर्निंग हेराल्ड, 28 अप्रैल 2002) और, 'मैं भगवान शब्द को कानूनों के अवतार के रूप में इस्तेमाल करूंगा। ऑफ फिजिक्स' (मास्टर ऑफ द यूनिवर्स, बीबीसी, 1989)। आइंस्टीन: 'समय के साथ, मुझे पता चला है कि हर चीज के पीछे एक आदेश है जिसे हम केवल परोक्ष रूप से देखते हैं [क्योंकि यह असहनीय रूप से सामना / निंदा करता है!]। यह धार्मिकता है। इस अर्थ में, मैं एक धार्मिक व्यक्ति हूं' (आइंस्टाइन रिवील्ड, पीबीएस, 1997)। इसलिए, अधिक गहन स्तर पर, जैसा कि बाइबल में कहा गया है, 'परमेश्वर प्रेम है' (१ यूहन्ना ४:८, १६)।

    फिर, समस्या यह थी कि जब तक हम मानवीय स्थिति की व्याख्या नहीं कर सकते, तब तक हम 'ईश्वर' को एकीकृत अर्थ के रूप में प्रकट करने का जोखिम नहीं उठा सकते थे और स्वीकार करते थे कि प्रेम बिना शर्त निःस्वार्थता है। यह कोई आश्चर्य की बात नहीं है कि हम मनुष्य, जैसा कि हम कहते हैं, 'ईश्वर-भयभीत' - वास्तव में, ईश्वर-पूजा होने की हद तक ईश्वर-भक्त रहे हैं - ईश्वर-सामना नहीं! आश्चर्य नहीं कि यांत्रिक विज्ञान को भी 'प्यार क्या है' के सवाल के इस परिहार का पालन करना पड़ा है, इतना कि यह मानवता के सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले, मूल्यवान में से एक होने के बावजूद 'प्रेम' की व्याख्या पेश करने में सक्षम नहीं है। और सार्थक शब्द! भाषाविद् रॉबिन अलॉट ने 'प्यार क्या है' के सवाल से बचने के लिए पारंपरिक रूप से वैज्ञानिक प्रतिष्ठान द्वारा इस्तेमाल किए जाने वाले बहाने का यह संक्षिप्त सारांश दिया: 'प्रेम को एक वर्जित विषय के रूप में वर्णित किया गया है, गंभीर नहीं, पृष्ठ 35 के लिए उपयुक्त नहीं है। पीडीएफ वर्जन साइंटिफिक स्टडी' ('इवोल्यूशनरी एस्पेक्ट्स ऑफ लव एंड एम्पैथी', जर्नल ऑफ सोशल एंड इवोल्यूशनरी सिस्टम्स, 1992, वॉल्यूम 15, नंबर 4, पीपी। 353-370)। वास्तव में, चोरी इस पैमाने की है कि 'अवसाद और सिज़ोफ्रेनिया (मानव स्वभाव के नकारात्मक पहलू) पर 100,000 से अधिक वैज्ञानिक अध्ययन प्रकाशित किए गए हैं, लेकिन निःस्वार्थ प्रेम पर एक दर्जन से अधिक अच्छे अध्ययन प्रकाशित नहीं हुए हैं' (विज्ञान और धर्मशास्त्र समाचार, फरवरी 2004)।

    हाँ, 'निःस्वार्थ प्रेम' की अवधारणा हमें इस सच्चाई के बहुत करीब ले गई कि प्रेम एकीकृत, बिना शर्त निस्वार्थ, 'ईश्वरीय' विषय या अस्तित्व का अर्थ है! इससे पहले कि हम इसका सामना कर सकें, हमें सबसे पहले अपनी कम-से-आदर्श-व्यवहार वाली मानवीय स्थिति की व्याख्या करनी होगी। इसलिए जबकि निश्चित रूप से एक-दूसरे से प्यार करने और पर्यावरण से प्यार करने की आवश्यकता के बारे में बहुत कुछ कहा गया है, पृथ्वी पर वास्तविक आवश्यकता और कारण स्वयं के अंधेरे पक्ष से प्यार करने के साधन खोजने के लिए, हमारे उस पहलू को समझने के लिए है। मेकअप। प्रसिद्ध मनोविश्लेषक कार्ल जंग हमेशा से कह रहे थे कि 'मनुष्यों के लिए पूर्णता उनकी अपनी छाया के मालिक होने की क्षमता पर निर्भर करती है' क्योंकि उन्होंने माना कि केवल हमारे अंधेरे, प्रेमहीन पक्ष की समझ ही हमारी मौलिक अच्छाई और मनुष्य के रूप में मूल्य के बारे में हमारी अंतर्निहित असुरक्षा को समाप्त कर सकती है। , ऐसा करते हुए, हमें 'संपूर्ण' बना दें। पूर्व-प्रतिष्ठित दार्शनिक सर लॉरेन्स वैन डेर पोस्ट उसी बिंदु को बना रहे थे जब उन्होंने कहा था, 'सच्चा प्यार मुश्किल और अप्रिय का प्यार है' (रूस में यात्रा, 1 9 64, पृष्ठ 145) और यह कि 'केवल यह समझने से कि हम कैसे थे एक ही समकालीन पैटर्न का एक हिस्सा [युद्ध, क्रूरता, लालच और उदासीनता] क्या हम उन अंधेरे ताकतों को उनकी प्रकृति और उत्पत्ति की सच्ची समझ के साथ हरा सकते हैं' (जंग एंड द स्टोरी ऑफ अवर टाइम, 1976, पृष्ठ 24)।

    सच्ची करुणा ही एकमात्र साधन था जिसके द्वारा हमारे ग्रह पर शांति और प्रेम आ सकता था, लेकिन इसे केवल समझ के द्वारा ही प्राप्त किया जा सकता था। वैन डेर पोस्ट के लेखन से फिर से आकर्षित: 'करुणा इस मान्यता का एक अमिट खाका छोड़ती है कि जीवन को एक व्यक्ति और दूसरे एक राष्ट्र और दूसरी संस्कृति और दूसरे के बीच बहुत आवश्यकता होती है। यह उस सड़क के लिए भी मान्य है जिसका निर्माण हमारी आत्मा को ऐतिहासिक रसातल को पार करने के लिए करना चाहिए जो अभी भी हमें जीवन की सही मायने में समकालीन दृष्टि से अलग करती है, और जीवन और अर्थ की वृद्धि जो हमें भविष्य में इंतजार कर रही है '(ibid। पी। 29)। हां, केवल हमारी प्रजातियों की प्रकृति और उत्पत्ति की 'सच्ची समझ' 'अच्छे-बुरे'-पीड़ित, यहां तक ​​​​कि 'गिर' या भ्रष्ट स्थिति हमें 'ऐतिहासिक रसातल' को पार करने की अनुमति दे सकती है जो 'अलग [डी] हमें ' एक 'करुणा [खाई]' से, मेल-मिलाप, सुधार, 'अर्थ [फुल]' स्वयं के बारे में। एक दिन द रोलिंग स्टोन्स को उद्धृत करने के लिए, 'शैतान के प्रति सहानुभूति' होनी ही थी - एक दिन, हमें मानव स्वभाव में 'अंधेरे बलों' की 'प्रकृति और उत्पत्ति' की 'सच्ची समझ' ढूंढनी थी। वास्तव में, मानव जाति की महान आशा, विश्वास, विश्वास और वास्तव में विश्वास यह रहा है कि मानव स्थिति की मुक्ति, पुनर्वास और इस प्रकार परिवर्तनकारी व्याख्या एक दिन मिल जाएगी - जो, सबसे अधिक राहत की बात है, यह अब अंत में है! हाँ, जंग और वैन डेर पोस्ट जिस 'भविष्य' की प्रतीक्षा कर रहे थे, वह हमारी मानवीय स्थिति को समझने के लिए था, अंत में यहाँ है! (फिर से, इस बात पर जोर दिया जाना चाहिए कि हमारी गहरी मनोवैज्ञानिक रूप से परेशान स्थिति की यह व्याख्या मनोविकृति से बचने, तुच्छ, बेईमान खाता नहीं है, जिसे ईओ विल्सन ने यूकोसियलिटी के अपने सिद्धांत में आगे रखा है, लेकिन मनोविकृति-संबोधन-और-समाधान , सच्चा, इसकी वास्तविक व्याख्या।)

    रोमांचक प्यार : 'प्यार क्या है' के सवाल के अन्य पहलुओं के बारे में, विशेष रूप से रोमांटिक प्रेम, बिना शर्त प्यार में रहने का सपना, किसी अन्य व्यक्ति के साथ पूरी तरह से एकीकृत राज्य (जैसा कि हम कहते हैं, हम 'प्यार में पड़ जाते हैं', हम खुद को सपने में छोड़ देते हैं मानव-शर्त-मुक्त, आदर्श संबंध), मुक्त रूप से उपलब्ध, ऑनलाइन पुस्तक FREEDOM में दिए गए स्पष्टीकरण को पढ़ें।

    पीडीएफ संस्करण का पृष्ठ ३६ तो, अद्भुत, सफलता, मेल-मिलाप, मुक्ति और इस प्रकार मनोवैज्ञानिक रूप से उपचार, हमारे प्रतीत-रहित, मानव-स्थिति-पीड़ित व्यवहार की सच्ची व्याख्या क्या है जो अंत में यह स्वीकार करना सुरक्षित बनाता है कि प्यार बिना शर्त निस्वार्थता है?

    निश्चित रूप से, हमने अपनी प्रजाति के प्रतीत-रहित, प्रतिस्पर्धी, स्वार्थी और आक्रामक व्यवहार को सही ठहराने के लिए बहाने गढ़े हैं, मुख्य यह है कि हमारे पास जंगली पशु प्रवृत्ति है जो हमें भोजन, आश्रय, क्षेत्र और एक साथी के लिए लड़ने और प्रतिस्पर्धा करने के लिए प्रेरित करती है। बेशक, यह 'व्याख्या', जिसे सामाजिक डार्विनवाद, समाजशास्त्र, विकासवादी मनोविज्ञान, बहुस्तरीय चयन और ई.ओ. के जैविक सिद्धांतों में आगे रखा गया है। विल्सन की सामाजिकता और मूल रूप से तर्क है कि 'जीन प्रतिस्पर्धी और स्वार्थी हैं और इसलिए हम हैं', हमारे प्रतिस्पर्धी, स्वार्थी और आक्रामक व्यवहार के लिए वास्तविक स्पष्टीकरण नहीं हो सकता है। सबसे पहले, यह इस तथ्य की अनदेखी करता है कि हमारे मानव व्यवहार में हमारा अद्वितीय पूर्ण रूप से सचेत सोच दिमाग शामिल है। अहंकारी, अभिमानी, भ्रमित, कृत्रिम, घृणास्पद, मतलबी, अनैतिक, अलग-थलग आदि जैसे विवरण, सभी हमारे व्यवहार के लिए एक चेतना-व्युत्पन्न, मनोवैज्ञानिक आयाम का संकेत देते हैं। असली मुद्दा - हमारे सोचने वाले दिमाग में मनोवैज्ञानिक समस्या जो हमने झेली है - हमारी मानवीय स्थिति की दुविधा है, हमारी प्रजाति का मुद्दा 'अच्छे-बुरे'-पीड़ित, कम-से-आदर्श, यहां तक ​​​​कि 'गिरा हुआ' ' या भ्रष्ट, राज्य।हम मनुष्य एक चेतना-व्युत्पन्न, मनोवैज्ञानिक मानव स्थिति से पीड़ित हैं, न कि एक वृत्ति-नियंत्रित पशु स्थिति से - हमारी स्थिति हमारे लिए पूरी तरह से जागरूक मनुष्यों के लिए अद्वितीय है। (सामाजिक डार्विनवाद, समाजशास्त्र, विकासवादी मनोविज्ञान, बहुस्तरीय चयन और सामाजिकता के सिद्धांतों का एक संक्षिप्त विवरण जो चेतना-व्युत्पन्न मनोविकृति के बजाय जंगली प्रवृत्ति पर हमारे विभाजनकारी व्यवहार को दोष देते हैं, विज्ञान क्या है? इस लेख, द बुक में प्रस्तुत किया गया है। सब कुछ के वास्तविक उत्तर! , मुक्त रूप से उपलब्ध, ऑनलाइन पुस्तक फ्रीडम: विस्तारित पुस्तक 1 ​​में प्रदान किए गए संपूर्ण खाते के साथ।

    दूसरा कारण यह है कि हमारे विभाजनकारी, स्वार्थी और आक्रामक व्यवहार के लिए बर्बर - वृत्ति-में-बहाना संभवतः वास्तविक स्पष्टीकरण नहीं हो सकता है कि यह इस तथ्य को अनदेखा करता है कि हम मनुष्यों के पास परोपकारी, सहकारी, प्रेमपूर्ण नैतिक प्रवृत्ति है - जिसे हम पहचानते हैं हमारा 'विवेक' - और हम में ये नैतिक प्रवृत्ति पारस्परिकता से उत्पन्न नहीं होती है, उन स्थितियों से जहां आप दूसरों से लाभ के बदले में केवल कुछ करते हैं, जैसा कि विकासवादी मनोवैज्ञानिक हमें विश्वास करेंगे। और न ही वे मनुष्यों के अन्य समूहों के साथ युद्ध करने से उत्पन्न हुए हैं क्योंकि यूकोसियलिटी के सिद्धांत के समर्थक हमें विश्वास करेंगे। नहीं, हमारे पास बिना शर्त निस्वार्थ, पूरी तरह से परोपकारी, वास्तव में प्यार करने वाला, सार्वभौमिक रूप से दूसरों का विचार करने वाला-गैर-प्रतिस्पर्धी-अन्य-समूहों, वास्तव में नैतिक विवेक है। हमारी मूल सहज स्थिति प्रतिस्पर्धी, स्वार्थी और आक्रामक होने के विपरीत थी: यह पूरी तरह से सहयोगी, निस्वार्थ और प्रेमपूर्ण थी। (हम मनुष्यों ने बिना शर्त निस्वार्थ नैतिक प्रवृत्ति कैसे प्राप्त की, जब ऐसा प्रतीत होता है कि एक बिना शर्त निस्वार्थ, पूरी तरह से परोपकारी गुण आत्म-उन्मूलन होने वाला है और इस प्रकार कभी भी एक प्रजाति में स्थापित होने में सक्षम नहीं है, संक्षेप में उपर्युक्त में समझाया गया है विज्ञान क्या है लेख, और अधिक पूरी तरह से स्वतंत्रता के अध्याय 5 में समझाया गया है - हालांकि, यहां यह बात कही जा रही है कि जंगली-प्रवृत्ति-में-बहाना इस तथ्य के साथ पूरी तरह से असंगत है कि हमारे पास वास्तविक और पूरी तरह से नैतिक प्रवृत्ति है, जंगली प्रवृत्ति नहीं है। चार्ल्स डार्विन ने हमारे नैतिक स्वभाव में अंतर को पहचाना जब उन्होंने कहा कि 'नैतिक भावना मनुष्य और निचले जानवरों के बीच सबसे अच्छा और उच्चतम अंतर प्रदान करती है' (मनुष्य का वंश, 1871, पृष्ठ 495)।

    तो, मानव-स्थिति से बचने के बजाय वास्तविक, मानव-स्थिति-संबोधन क्या है, हमारी प्रजातियों की जैविक व्याख्या 'वर्तमान प्रतीत होता है-अत्यधिक-अपूर्ण, प्रतिस्पर्धी, स्वार्थी और आक्रामक व्यवहार? उत्तर चेतना के विश्लेषण से शुरू होता है।

    पीडीएफ संस्करण का पृष्ठ 37 बहुत संक्षेप में, नसों को मूल रूप से जानवरों में आंदोलन के समन्वय के लिए विकसित किया गया था, लेकिन, एक बार विकसित होने के बाद, छापों को संग्रहीत करने की उनकी क्षमता - जिसे हम 'स्मृति' के रूप में संदर्भित करते हैं - ने समझ विकसित करने की क्षमता को जन्म दिया। कारण और प्रभाव का। यदि आप पिछली घटनाओं को याद कर सकते हैं, तो आप उनकी तुलना वर्तमान घटनाओं से कर सकते हैं और नियमित रूप से होने वाले अनुभवों की पहचान कर सकते हैं। अतीत में आमतौर पर क्या हुआ है, इसका ज्ञान या अंतर्दृष्टि आपको यह अनुमान लगाने में सक्षम बनाती है कि भविष्य में क्या होने की संभावना है और उसके अनुसार अपने व्यवहार को समायोजित करें। एक बार परिवर्तन की प्रकृति में अंतर्दृष्टि को लागू करने के बाद, स्व-संशोधित व्यवहार प्रतिक्रिया प्रदान करना शुरू कर देता है, अंतर्दृष्टि को और परिष्कृत करता है। भविष्यवाणियों की तुलना परिणामों आदि से की जाती है। मानव मस्तिष्क में बहुत विकसित, और इस तरह का शोधन हुआ, तंत्रिकाएं जानकारी को पर्याप्त रूप से इस कारण से जोड़ सकती हैं कि अनुभव कैसे संबंधित हैं, समझना सीखें और जागरूक बनें, या जागरूक हों, या समय के साथ होने वाली घटनाओं के बीच के संबंध के बारे में बुद्धिमान बनें। इस प्रकार चेतना का अर्थ इस बात से पर्याप्त रूप से अवगत होना है कि अनुभव कैसे समझ के आधार से परिवर्तन को प्रबंधित करने के प्रयास से संबंधित हैं।

    इस प्रक्रिया के बारे में इतना महत्वपूर्ण यह है कि एक बार जब हमारी तंत्रिका-आधारित सीखने की प्रणाली हमारे जागरूक होने और घटनाओं को प्रभावी ढंग से प्रबंधित करने में सक्षम होने के लिए पर्याप्त रूप से विकसित हो गई, तो हमारी सचेत बुद्धि तब हमारे जीन-आधारित सीखने की प्रवृत्ति से नियंत्रण हासिल करने की स्थिति में थी। , जो उस समय तक हमारे जीवन को नियंत्रित कर रहा था। मूल रूप से, एक बार हमारी आत्म-समायोजन बुद्धि उभरने के बाद यह हमारे जीवन के प्रबंधन को सहज प्रवृत्तियों से लेने में सक्षम थी जो हमने आनुवंशिक लक्षणों के प्राकृतिक चयन के माध्यम से हासिल की थी जो हमें हमारे पर्यावरण के अनुकूल बनाती थी।

    हालाँकि, यह इस समय था, जब हमारी सचेत बुद्धि ने नियंत्रण के लिए हमारी वृत्ति को चुनौती दी, कि हमारी प्रवृत्ति और बुद्धि के बीच एक भयानक लड़ाई छिड़ गई, जिसका प्रभाव अत्यंत प्रतिस्पर्धी, स्वार्थी और आक्रामक स्थिति थी जिसे हम मानवीय स्थिति कहते हैं।

    विस्तृत करने के लिए, जब हमारी चेतन बुद्धि का उदय हुआ तो यह न तो उपयुक्त था और न ही इसके लिए वृत्ति द्वारा उन्मुख होने के लिए - इसे प्रभावी ढंग से संचालित करने और जीवन को प्रबंधित करने की अपनी महान क्षमता को पूरा करने के लिए समझ ढूंढनी थी। हालाँकि, जब हमारी बुद्धि ने जीवन के प्रबंधन में खुद को समझने और प्रयोग करने के लिए पहले से ही स्थापित सहज आत्म की भूमिका को चुनौती देना शुरू कर दिया, तो स्वाभाविक रूप से सहज आत्म और नए सचेत स्व के बीच एक लड़ाई छिड़ गई।

    हमारी बुद्धि ने अस्तित्व के प्रबंधन के लिए सही और गलत समझ की खोज के एकमात्र साधन के रूप में समझने में प्रयोग करना शुरू कर दिया, लेकिन वृत्ति - इन प्रयोगों को करने के लिए बुद्धि की आवश्यकता से 'अनजान' या 'अज्ञानी' होने के कारण - किसी भी 'विरोध' स्थापित सहज प्रवृत्तियों से समझ-उत्पादित विचलन: उन्होंने ज्ञान के लिए चेतन मन की आवश्यक खोज की 'आलोचना' की और 'रोकने की कोशिश' की। स्थिति को स्पष्ट करने के लिए, कल्पना कीजिए कि अगर हम एक प्रवासी पक्षी के सिर पर पूरी तरह से सचेत दिमाग रख दें तो क्या होगा। पक्षी प्राकृतिक चयन की हजारों पीढ़ियों से प्राप्त एक सहज उड़ान पथ का अनुसरण कर रहा है, लेकिन अब उसके पास एक सचेत दिमाग है जिसे यह समझने की आवश्यकता है कि कैसे व्यवहार करना है, और उस समझ को प्राप्त करने का एकमात्र तरीका समझ में प्रयोग करना है - उदाहरण के लिए, सोच रहा था, 'मैं उस द्वीप पर उड़ जाऊंगा और आराम करूंगा।' लेकिन प्रवासी उड़ान पथ से इस तरह के विचलन का परिणाम स्वाभाविक रूप से विचलन का विरोध करने वाली वृत्ति में होगा, जिससे सचेत बुद्धि एक गंभीर दुविधा में पड़ जाएगी: यदि यह अपनी प्रवृत्ति का पालन करता है यह अपनी वृत्ति से 'आलोचना' महसूस नहीं करेगा लेकिन न ही इसे ज्ञान मिलेगा। जाहिर है, बुद्धि वृत्ति को देने में असमर्थ थी, और समझने में असमर्थ थी और इस प्रकार यह समझाने में असमर्थ थी कि आत्म-समायोजन में इसके प्रयोग क्यों आवश्यक थे, जागरूक बुद्धि के पास पीडीएफ संस्करण के पृष्ठ 38 को वृत्ति से निहित आलोचना का खंडन करने का कोई तरीका नहीं था। जबकि यह जानता था कि यह अन्यायपूर्ण है। जब तक चेतन मन को इस बात की मुक्ति की समझ नहीं मिली कि उसे वृत्ति का उल्लंघन क्यों करना पड़ा (अर्थात् जीन और तंत्रिकाओं की जानकारी के तरीके में अंतर की वैज्ञानिक समझ, कि एक एक उन्मुख सीखने की प्रणाली है जबकि दूसरा एक व्यावहारिक सीखने की प्रणाली है), बुद्धि को एक मनोवैज्ञानिक रूप से व्यथित, परेशान स्थिति को सहने के लिए छोड़ दिया गया था, उसके पास वृत्ति से उस विरोध का विरोध करने के अलावा कोई विकल्प नहीं था। चेतन बुद्धि के लिए उपलब्ध अवज्ञा के एकमात्र रूप थे: आक्रमण वृत्ति की अन्यायपूर्ण आलोचना, करने का प्रयास करें मना करना या उसके दिमाग से वृत्ति की अन्यायपूर्ण आलोचना को रोकें, और प्रयास करें साबित करना वृत्ति की अन्यायपूर्ण आलोचना गलत। संक्षेप में - और हमारी मानवीय स्थिति पर लौटने के लिए क्योंकि हम पूरी तरह से चेतन मन प्राप्त करने वाली प्रजाति थे - मनोवैज्ञानिक रूप से परेशान गुस्सा, अलग-थलग तथा अहंकारपूर्ण मानव-स्थिति-पीड़ित राज्य प्रकट हुआ। हमारी 'सचेत सोच स्वयं', जो 'अहंकार' की शब्दकोश परिभाषा है, 'केंद्रित' हो गई या खुद को सही ठहराने की आवश्यकता पर केंद्रित हो गई। हम अहंकार-केंद्रित, आत्म-केंद्रित या स्वार्थी बन गए, हम अच्छे हैं और बुरे नहीं हैं, यह साबित करने के अवसरों के लिए आक्रामक रूप से प्रतिस्पर्धा करने में व्यस्त हैं - हम अपरिहार्य रूप से बन गए स्वार्थी, आक्रामक तथा प्रतियोगी.

    मानव स्थिति की इस व्याख्या के बारे में इतना क्षमाशील, पुनर्वास और उपचार यह है कि हम अंततः इस बात की सराहना कर सकते हैं कि हमारे क्रोधित, अलग-थलग और अहंकारी व्यवहार का एक बहुत अच्छा कारण था - वास्तव में, अब हम देख सकते हैं कि हम अभी क्यों नहीं हैं इतनी अन्यायपूर्ण आलोचना के साथ जीने के लिए अहंकार-केंद्रित, लेकिन अहंकार-क्रोधित, यहां तक ​​​​कि अहंकार-पागल-पागल-हत्या-क्रोध। अब हम देख सकते हैं कि हमारा चेतन मन वह दुष्ट खलनायक नहीं था जिसे इतने लंबे समय से चित्रित किया गया है - जैसे कि बाइबिल में जहां आदम और हव्वा को राक्षसी बनाया गया था और 'ईडन गार्डन से निर्वासित किया गया था' (जनरल 3: 23)। 'ज्ञान के वृक्ष से फल...' लेने के लिए हमारी मूल निर्दोष, सर्वप्रिय, नैतिक स्थिति (ibid. 3:3, 2:17)। नहीं, विज्ञान ने आखिरकार हमें मानव जाति से तथाकथित 'अपराध का बोझ' उठाने में सक्षम बनाया है, यह समझने के लिए कि हम सोच रहे हैं, 'ज्ञान' -खोज, जागरूक इंसान वास्तव में कहानी के नायकों से कम नहीं हैं धरती पर जीवन! ऐसा इसलिए है क्योंकि हमारा पूरी तरह से चेतन मन निश्चित रूप से प्रकृति का सबसे बड़ा आविष्कार है और इतने लंबे समय तक बुराई के रूप में अन्यायपूर्ण रूप से निंदा किए जाने की यातना को सहना पड़ा है (मानवशास्त्रीय साक्ष्य इंगित करते हैं कि हम मनुष्य लगभग दो मिलियन वर्षों से पूरी तरह से सचेत हैं) हमें पृथ्वी पर जीवन की कहानी के पूर्ण नायक। अंत में, ईश्वर और मनुष्य, धर्म और विज्ञान, हमारी वृत्ति और बुद्धि, जीवन का एकीकृत अर्थ और उस अर्थ के साथ हमारे व्यवहार की असंगति, हमारी प्रेमपूर्ण और अप्रिय स्थितियाँ, सभी में सामंजस्य है।

    और सबसे अच्छा, क्योंकि मानव स्थिति की यह व्याख्या मुक्तिदायक है और इस प्रकार पुनर्वास कर रही है, हमारे सभी परेशान क्रोधित, अहंकारी और अलग-थलग व्यवहार अब कम हो जाते हैं, जिससे मानव जाति का पूर्ण परिवर्तन होता है - और महत्वपूर्ण रूप से, मानव स्थिति की समझ ' वह 'बुरे' व्यवहार को क्षमा नहीं करता, वह ठीक करता है और ऐसा करने से वह समाप्त हो जाता है। प्रतिस्पर्धी, स्वार्थी और आक्रामक होने से मनुष्य सहकारी, निस्वार्थ और प्रेमपूर्ण होने की ओर लौटता है। हमारे जाने का दौर समाप्त हो गया है। कवि टी.एस. एलियट ने आश्चर्यजनक रूप से हमारी प्रजाति की यात्रा को एक मूल निर्दोष, फिर भी अज्ञानी, राज्य, एक मनोवैज्ञानिक रूप से परेशान 'गिर', भ्रष्ट राज्य, और एक अनियंत्रित स्थिति में वापस जाने के लिए व्यक्त किया, लेकिन इस बार प्रबुद्ध, राज्य जब उन्होंने लिखा, 'हम इससे नहीं रुकेंगे अन्वेषण और हमारे सभी अन्वेषणों का अंत उस स्थान पर पहुंचना होगा जहां हमने शुरुआत की थी और पहली बार उस स्थान को जानना होगा' (लिटिल गिडिंग, 1942)।

    हां, हमारे अंधेरे, प्रतीत होता है-अप्रिय, मनोवैज्ञानिक रूप से परेशान, मानव-स्थिति-पीड़ित अस्तित्व की क्षमाशील, मुक्तिदायक समझ को ढूंढना अंततः मानव जाति को चंगा करने में सक्षम बनाता है और इस प्रकार रूपांतरित होता है - यह हमें फिर से 'संपूर्ण' बनाता है, जैसा कि जंग ने कहा था . पीडीएफ वर्जन एसोसिएशन के कनाडाई मनोरोग पृष्ठ 39 के पूर्व अध्यक्ष प्रोफेसर हैरी प्रोसेन को उद्धृत करने के लिए, इस सपने के बारे में, विज्ञान में सभी सफलताओं में से सबसे बड़ी: 'मुझे इसमें कोई संदेह नहीं है कि मानव स्थिति की यह जैविक व्याख्या पवित्र कब्र है मानव जाति के मनोवैज्ञानिक पुनर्वास के लिए हमने जो अंतर्दृष्टि मांगी है' (स्वतंत्रता, 2016, परिचय)।


    निष्कर्ष

    एक पूर्ण जीनोम अनुक्रम और कई उभरते उपकरणों के साथ, पी. पेटेंट पादप अनुसंधान के यीस्ट समकक्ष के रूप में उभर रहा है। पी. पेटेंट अधिकांश संवहनी पौधों की तुलना में तेजी से प्रचारित, आसानी से रूपांतरित और विकास और आकारिकी में अपेक्षाकृत सरल है। यद्यपि इसका जीनोम आवश्यक रूप से संवहनी पादप जीनोम का 'स्ट्रिप्ड-डाउन' संस्करण नहीं है, इस संयंत्र में जिस आसानी से आनुवंशिक जोड़-तोड़ किया जा सकता है, उसने थोड़े समय में, कई महत्वपूर्ण निष्कर्षों को बनाने में सक्षम बनाया है, जिसमें पौधे के विकास से लेकर पौधे के विकास तक शामिल हैं। कोशिका वृद्धि के आणविक आधार के रास्ते को शांत करना।


    स्वीकृतियाँ

    इस काम को एनआईएच अनुदान K01HG003418-02 और GM059964-06S1 द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक हार्वर्ड-एमआईटी डिवीजन ऑफ हेल्थ साइंसेज में बच्चों के अस्पताल बोस्टन इंफॉर्मेटिक्स प्रोग्राम के निदेशक इसहाक कोहेन से प्रयोगशाला समर्थन और प्रोत्साहन के लिए विशेष रूप से आभारी हैं। इस काम को शुरू में प्रेरित करने और सेल साइकिल मशीनरी, मॉडलिंग और सिस्टम बायोलॉजी की कई उपयोगी चर्चाओं के लिए स्टोवर्स इंस्टीट्यूट फॉर मेडिकल रिसर्च में सहयोगी और दोस्त रोंग ली को विशेष धन्यवाद।


    वह वीडियो देखें: EPIC Minecraft Kingdoms Of Greymane - Transformation! (फरवरी 2023).