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जैविक अनुसंधान में फेज-कंट्रास्ट और डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोपी का कितना उपयोग किया जाता है?

जैविक अनुसंधान में फेज-कंट्रास्ट और डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोपी का कितना उपयोग किया जाता है?


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आज जैविक अनुसंधान में फेज-कंट्रास्ट और डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोपी का कितना उपयोग किया जाता है? ऐसा लगता है कि इनका आविष्कार बहुत पहले हो गया था, इसलिए मैं सोच रहा हूं कि क्या इन तकनीकों को सीखना एक अच्छा विचार होगा। (मैं अगले वसंत में जीव विज्ञान में एक स्नातक कार्यक्रम शुरू करूंगा ... लेकिन मुझे अभी भी ज्यादातर दिलचस्पी है कि शोधकर्ता इन तकनीकों का कितना उपयोग करते हैं: यदि थोड़ा है, तो मुझे अपने समय का बेहतर उपयोग करना चाहिए)


मैं बहुत बार फेज कंट्रास्ट का उपयोग करता हूं, क्योंकि यह केवल एक लेंस समूह को उज्ज्वल क्षेत्र से स्विच करने की बात है। धुंधला होने, या इससे भी बदतर, इम्यूनोस्टेनिंग के साथ घंटों बिताने के बजाय, मुझे कुछ सेकंड में बड़ी तस्वीर (सेल व्यास) मिलती है। मैं अगले दिन भी उन्हीं कक्षों में वापस जा सकता हूं। डार्क-फील्ड में स्विच करना भी डायल को मोड़ने या स्विच को पुश करने की बात है।

यदि आप पहले से ही ब्राइटफील्ड का उपयोग करते हैं, तो वास्तव में उपयोगी भौतिकी, या नमूना तैयार करने के संदर्भ में उनके बारे में जानने के लिए बहुत कुछ नहीं है। जो चीजें आप सीख सकते हैं - कहते हैं, कि रंग डार्कफ़ील्ड में बदल जाते हैं - व्यवहार में शायद ही कभी इसकी आवश्यकता होगी। ये विधियां ऐसी चीजें हैं जिन्हें आपको वास्तव में गहराई से जानने की आवश्यकता नहीं है जब तक कि आपके प्रयोगों की आवश्यकता न हो। फिर भी, उन्नत प्रकाशिकी की तुलना में अभ्यास और कोहनी का तेल अधिक सहायक होगा। याद रखें कि ज्यादातर मामलों में, वैज्ञानिक परिकल्पना उन उपकरणों की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण है जिनका उपयोग आप इसे हल करने के लिए कर सकते हैं।


यदि आप किसी भी प्रकार के कोशिका जीव विज्ञान कार्य करने की योजना बना रहे हैं (और यदि आप जीव विज्ञान में जा रहे हैं, तो यह लगभग निश्चित है कि आप किसी बिंदु पर होंगे), माइक्रोस्कोप का उपयोग करना सीखना आवश्यक है। जब आप बढ़ती हुई कोशिकाओं को उनकी आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने, उनकी गणना करने, संदूषण के संकेतों की तलाश करने, विभेदीकरण की कल्पना करने आदि के लिए अक्सर एक गुंजाइश का उपयोग करेंगे। इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते समय माइक्रोस्कोप का भी उपयोग किया जाता है।

इसलिए, भले ही उपकरण और कुछ तकनीकें काफी समय से आसपास हैं, फिर भी वे आज भी बहुत प्रासंगिक हैं।


38 - चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग

फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी मोनोन्यूक्लियर फागोसाइट्स की आकृति विज्ञान की जांच के लिए एक बहुत ही उपयोगी और शक्तिशाली उपकरण है। प्रकाश माइक्रोस्कोपी में, एक नमूने से गुजरने वाले प्रकाश में होने वाले दो महत्वपूर्ण परिवर्तन आयाम या चरण में परिवर्तन होते हैं। पारंपरिक उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के लिए, किसी वस्तु के भीतर दाग वाले नमूनों के विपरीत माइक्रोस्कोपी मुख्य रूप से प्रकाश अवशोषण में अंतर के द्वारा लाया जाता है। चरण माइक्रोस्कोपी के लिए रोशनी के लिए एक प्रकाश स्रोत की आवश्यकता होती है जो कि सबस्टेज कंडेनसर के रियर फोकल प्लेन में एक अपेक्षाकृत संकीर्ण रेखा होती है। कंडेनसर और उद्देश्य के ठीक से केंद्रित होने से, प्रकाश तरंगें जो कुंडलाकार स्रोत में एक बिंदु पर उत्पन्न होती हैं, फील्ड प्लेन से गुजरते समय किरणों का एक समानांतर बंडल बनाती हैं। चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी में, नमूने से निकलने वाले प्रत्यक्ष बनाम विवर्तित प्रकाश के चरण में परिवर्तन वस्तु को दृश्यमान बनाता है। अपवर्तक सूचकांक या प्रकाश पथ की लंबाई में परिवर्तन मुख्य रूप से एक नमूने के किनारों पर होते हैं, इस प्रकार, चरण घटना को एक बढ़त प्रभाव बनाते हैं।


जैविक अनुसंधान में फेज-कंट्रास्ट और डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोपी का कितना उपयोग किया जाता है? - जीव विज्ञान

चार्लोट के. ओमोटो*
*आनुवंशिकी और कोशिका जीव विज्ञान विभाग

जोन फोल्वेल#
#जूलॉजी विभाग

वाशिंगटन स्टेट यूनिवर्सिटी
पीओ बॉक्स 644234
पुलमैन, डब्ल्यूए 99164-4234
आवाज: (509) 335-5591
फैक्स: (509) 335-1907

परिचय

प्रकाश माइक्रोस्कोपी जीव विज्ञान के लिए एक महत्वपूर्ण खोजी उपकरण है जिसका उपयोग हाई स्कूलों और कॉलेजों में नियमित रूप से किया जाता है। कई जैविक नमूनों की संरचना कम विपरीत होती है जिसे ब्राइटफील्ड यौगिक सूक्ष्मदर्शी द्वारा प्रकट नहीं किया जा सकता है जो कई कक्षाओं में प्रदान किए जाते हैं। माइक्रोस्कोप जो विशेष प्रकाशिकी के माध्यम से इन नमूनों के विपरीत में सुधार करते हैं, अधिकांश शिक्षण बजट के लिए निषेधात्मक रूप से महंगे हैं। यह लेख एक सरल, सस्ते संशोधन का वर्णन करता है जो एक ब्राइटफ़ील्ड माइक्रोस्कोप को एक डार्कफ़ील्ड माइक्रोस्कोप में बदल देता है जिससे कम कंट्रास्ट नमूनों की जांच की जा सकती है। यह लेख डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी के मूल सिद्धांत की व्याख्या करता है। ब्राइटफ़ील्ड और डार्कफ़ील्ड एप्लिकेशन की तुलना करने वाले फ़ोटोग्राफ़ प्रस्तुत किए गए हैं। यह तकनीक बहुत कम हेरफेर या खर्च के साथ शिक्षण के सभी स्तरों पर ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के विस्तारित उपयोग की अनुमति देती है।

डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी का सिद्धांत

सूक्ष्मदर्शी का उपयोग वस्तुओं को बड़ा करने के लिए किया जाता है। आवर्धन के माध्यम से, एक छवि मूल वस्तु से बड़ी दिखाई देने के लिए बनाई जाती है। किसी वस्तु के आवर्धन की गणना मोटे तौर पर उद्देश्य लेंस के आवर्धन को ओकुलर लेंस के आवर्धन से गुणा करके की जा सकती है। छोटे विवरण देखने में सक्षम होने के लिए वस्तुओं को बड़ा किया जाता है। आवर्धन की कोई सीमा नहीं है जिसे प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन एक आवर्धन है जिसके आगे विस्तार स्पष्ट नहीं होता है। परिणाम को खाली आवर्धन कहा जाता है जब वस्तुओं को बड़ा किया जाता है लेकिन उनका विवरण स्पष्ट नहीं होता है। इसलिए, एक छवि में जानकारी की गुणवत्ता के लिए न केवल आवर्धन बल्कि संकल्प महत्वपूर्ण है।

माइक्रोस्कोप की संकल्प शक्ति को दो बिंदुओं को एक दूसरे से अलग करने की क्षमता के रूप में परिभाषित किया गया है। माइक्रोस्कोप का रिज़ॉल्यूशन इसके निर्माण में कई कारकों पर निर्भर करता है। दृश्य प्रकाश (400-600nm) की तरंग दैर्ध्य द्वारा लगाए गए संकल्प की एक अंतर्निहित सैद्धांतिक सीमा भी है। संकल्प की सैद्धांतिक सीमा (दो बिंदुओं के बीच देखी जा सकने वाली सबसे छोटी दूरी) की गणना इस प्रकार की जाती है:

जहाँ l प्रयुक्त प्रकाश की तरंगदैर्घ्य का प्रतिनिधित्व करता है और N.A. संख्यात्मक एपर्चर है। छात्र-श्रेणी के सूक्ष्मदर्शी में आमतौर पर कम गुणवत्ता वाले लेंस और रोशनी प्रणालियों के कारण सैद्धांतिक सीमा से बहुत कम रिज़ॉल्यूशन होता है।

मानक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी सबस्टेज कंडेनसर द्वारा एकत्रित किए जा रहे दीपक स्रोत से प्रकाश पर निर्भर करता है और एक शंकु के आकार का होता है जिसका शीर्ष नमूना के विमान पर केंद्रित होता है। नमूनों को उनकी गति को बदलने की क्षमता और उनके माध्यम से गुजरने वाले प्रकाश के मार्ग के कारण देखा जाता है। यह क्षमता अपवर्तक सूचकांक और नमूने की अस्पष्टता पर निर्भर है। एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप में एक नमूना देखने के लिए, इसके माध्यम से गुजरने वाली प्रकाश किरणों को एक दूसरे के साथ हस्तक्षेप करने में सक्षम होने के लिए पर्याप्त रूप से बदला जाना चाहिए जो विपरीत (प्रकाश तीव्रता में अंतर) पैदा करता है और इस प्रकार, एक छवि का निर्माण करता है। यदि नमूने का अपवर्तनांक सूक्ष्मदर्शी चरण और वस्तुनिष्ठ लेंस के बीच के आसपास के माध्यम के समान है, तो यह दिखाई नहीं देगा। जैविक सामग्री की अच्छी तरह से कल्पना करने के लिए, सामग्री में उचित अपवर्तक सूचकांकों के कारण यह अंतर्निहित कंट्रास्ट होना चाहिए या कृत्रिम रूप से दागदार होना चाहिए। इन सीमाओं के लिए प्रशिक्षकों को स्वाभाविक रूप से उच्च विपरीत सामग्री खोजने या उन्हें धुंधला करके विपरीतता बढ़ाने की आवश्यकता होती है जिसके लिए अक्सर उन्हें मारने की आवश्यकता होती है। ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप से पारदर्शी जीवित सामग्री या पतले बिना दाग वाले नमूनों की पर्याप्त रूप से कल्पना करना संभव नहीं है।

डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी एक अलग रोशनी प्रणाली पर निर्भर करता है। नमूने को प्रकाश के भरे हुए शंकु से रोशन करने के बजाय, कंडेनसर को प्रकाश का एक खोखला शंकु बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। शंकु के शीर्ष पर प्रकाश नमूने के तल पर केंद्रित होता है क्योंकि यह प्रकाश नमूना विमान से आगे बढ़ता है और फिर से एक खोखले शंकु में फैलता है। ऑब्जेक्टिव लेंस इस शंकु के गहरे खोखले में बैठता है, हालांकि प्रकाश ऑब्जेक्टिव लेंस के चारों ओर घूमता है और उसमें प्रवेश नहीं करता है (चित्र 1)। जब माइक्रोस्कोप चरण पर कोई नमूना नहीं होता है तो पूरा क्षेत्र अंधेरा दिखाई देता है इसलिए इसे डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी नाम दिया गया है। जब एक नमूना मंच पर होता है, तो शंकु के शीर्ष पर प्रकाश उस पर पड़ता है। छवि केवल उन किरणों द्वारा बनाई जाती है जो नमूने द्वारा बिखरी हुई होती हैं और वस्तुनिष्ठ लेंस में कैद होती हैं (चित्र 1 में नमूने द्वारा बिखरी हुई किरणों को नोट करें)। छवि अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ उज्ज्वल दिखाई देती है। इस स्थिति की तुलना एक अंधेरे कमरे में धूल के कणों की चमकदार उपस्थिति से की जा सकती है, जो एक साइड की खिड़की से आने वाली रोशनी के मजबूत शाफ्ट से प्रकाशित होती है। धूल के कण बहुत छोटे होते हैं, लेकिन प्रकाश किरणों को बिखेरने पर आसानी से दिखाई देते हैं। यह डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी का कार्य सिद्धांत है और बताता है कि कम कंट्रास्ट सामग्री की छवि कैसे बनाई जाती है: एक वस्तु को एक अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ देखा जाएगा यदि वह प्रकाश को बिखेरती है जिसे उचित उपकरण जैसे कि एक उद्देश्य लेंस के साथ कैप्चर किया जाता है।

उच्चतम गुणवत्ता वाले डार्कफ़ील्ड सूक्ष्मदर्शी केवल डार्कफ़ील्ड अनुप्रयोग के लिए निर्मित विशेष महंगे कंडेनसर से लैस हैं। यह डार्कफ़ील्ड प्रभाव एक ब्राइटफ़ील्ड माइक्रोस्कोप में प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि, एक साधारण "स्टॉप" के अतिरिक्त। स्टॉप अपारदर्शी सामग्री का एक टुकड़ा है जिसे सबस्टेज कंडेनसर के नीचे रखा जाता है, यह माइक्रोस्कोप के आधार से आने वाले प्रकाश की किरण के केंद्र को अवरुद्ध करता है और डार्कफील्ड रोशनी के लिए आवश्यक प्रकाश के खोखले शंकु का निर्माण करता है।

प्रक्रियाओं

    कार्ल जीस यूएसए
    माइक्रोस्कोपी डिवीजन
    1-800-233-2343
    (स्थानीय प्रतिनिधि का नाम और संख्या पूछें)

यदि आपके सूक्ष्मदर्शी के लिए निर्मित डार्कफ़ील्ड स्टॉप उपलब्ध नहीं है, तो कुछ विकल्प हैं। यदि कंडेनसर के नीचे एक फिल्टर होल्डर है, तो किसी अन्य कंपनी का डार्क फील्ड स्टॉप फिट हो सकता है या फिट किया जा सकता है। एक स्पष्ट डिस्क के केंद्र में एक सिक्का या अन्य अपारदर्शी सामग्री का एक चक्र लगाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, कांच, और डाला गया। ब्लैक कंस्ट्रक्शन पेपर के एक सर्कल को पंच करके एक स्टॉप भी बनाया जा सकता है, सर्कल डबल-स्टिक टेप के साथ कंडेनसर के नीचे से जुड़ा हुआ है। यह विकल्प थोड़ा मुश्किल हो सकता है क्योंकि सामग्री को कंडेनसर के केंद्र में रखने की आवश्यकता होती है और टेप को हटाते समय कंडेनसर को साफ करने की आवश्यकता होती है। तकनीकी रूप से, बीम को ठीक से अवरुद्ध करने के लिए, उद्देश्य लेंस के आवर्धन और संख्यात्मक एपर्चर के आधार पर स्टॉप व्यास में 8 मिमी से 20 मिमी तक भिन्न होना चाहिए।

डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी दो तरह से माइक्रोस्कोप के लेंस सिस्टम में प्रवेश करने वाले प्रकाश की मात्रा को कम करता है। सबसे पहले, स्टॉप प्रकाश की किरण के केंद्र को अवरुद्ध करता है जो अन्यथा उद्देश्य लेंस को भर देगा। दूसरा, केवल वही प्रकाश दिखाई देता है जो नमूने द्वारा बिखरा हुआ होता है और वस्तुनिष्ठ लेंस में प्रवेश करता है। इसलिए, सर्वोत्तम देखने के परिणाम के लिए जितना संभव हो प्रकाश की तीव्रता को बढ़ाने की आवश्यकता होती है: प्रकाश तीव्रता समायोजन को अधिकतम पर सेट करके, क्षेत्र डायाफ्राम खोलकर, कंडेनसर एपर्चर खोलकर, और किसी भी रंग या अन्य फ़िल्टर को हटाकर। सही सूक्ष्मदर्शी स्लाइड का भी उपयोग किया जाना चाहिए, वे 1 मिमी मोटी होनी चाहिए।

सर्वोत्तम छवि प्राप्त करने के लिए रोशनी को संरेखित और समायोजित करने की आवश्यकता है। डार्कफ़ील्ड संशोधन करने से पहले, निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रकाश किरण को देखने के क्षेत्र के केंद्र में संरेखित करें। सबस्टेज कंडेनसर और ऑब्जेक्टिव लेंस पर ध्यान केंद्रित करने की सुविधा के लिए, नमूनों से भरी एक स्लाइड का उपयोग करें जो गाल सेल स्लाइड का पालन करने के लिए निर्देश खोजने में आसान हो। ब्राइटफ़ील्ड मोड में नमूना स्लाइड को कम आवर्धन (10X) पर फ़ोकस करें। फ़ोकस बदले बिना डार्कफ़ील्ड स्टॉप डालें। सुनिश्चित करें कि प्रकाश की अधिकतम मात्रा उपलब्ध है। कंडेनसर फोकस नॉब के साथ कंडेनसर को उसके उच्चतम स्थान पर रैक करें। नमूने को देखें और कंडेनसर को धीरे-धीरे कम करें जब तक कि नमूना एक गहरे रंग की पृष्ठभूमि के खिलाफ और सबसे तेज विपरीत में दिखाई न दे। अंत में, ठीक फ़ोकस नॉब के साथ छवि के दृश्य को समायोजित करें।

डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी की सीमा

डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी का लाभ भी इसका नुकसान बन जाता है: न केवल नमूना, बल्कि धूल और अन्य कण प्रकाश को बिखेरते हैं और आसानी से देखे जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, न केवल गाल कोशिकाएं बल्कि लार में बैक्टीरिया चित्र 2डीमें स्पष्ट हैं। डार्कफील्ड अनुप्रयोग में नमूना तैयार करने में अधिक सावधानी बरतने की आवश्यकता है। कांच की स्लाइडों को बाहरी धूल और गंदगी से अच्छी तरह साफ करने की जरूरत है। भ्रामक संदूषकों को बाहर करने के लिए नमूना मीडिया (अगर, पानी, खारा) को फ़िल्टर करना आवश्यक हो सकता है। नमूना सामग्री को बहुत कम फैलाने की आवश्यकता होती है स्लाइड पर बहुत अधिक सामग्री कई अतिव्यापी परतें और किनारों को बनाती है जिससे संरचनाओं की व्याख्या करना मुश्किल हो जाता है।

छवि बनाने के लिए, यह तकनीक नमूनों से बिखरी हुई रोशनी पर निर्भर करती है। रंग की कमी है या कम से कम यह दर्शकों के लिए निराशाजनक हो सकता है। नमूनों का वास्तविक आकार भी प्रभावित होता है वस्तुओं की चौड़ाई अतिरंजित हो जाती है।

डार्कफील्ड छवियों के उदाहरण।

चित्र 2 ब्राइटफ़ील्ड और डार्कफ़ील्ड मोड में जीवित क्लैमाइडोमोनस, एक बाइफ़्लैजेलेट शैवाल की छवियों की तुलना करता है। यद्यपि कोशिकाओं को ब्राइटफील्ड के साथ देखा जाता है, कशाभिकाएं स्पष्ट नहीं होती हैं (चित्र 2ख)। कंडेनसर एपर्चर डायाफ्राम को बंद करके कुछ विपरीत प्राप्त किया जा सकता है जो तब फ्लैगेला को देखने की अनुमति देता है (चित्र 2 ए)। हालांकि, कंडेनसर एपर्चर को बंद करने से ऑब्जेक्टिव लेंस का संख्यात्मक एपर्चर कम हो जाता है जिससे रिज़ॉल्यूशन प्रभावी रूप से कम हो जाता है। डार्कफील्ड फ्लैगेला और अंदर के विवरण को स्पष्ट रूप से देखने की अनुमति देता है (चित्र 2सी)। इस प्रकार डार्कफ़ील्ड माइक्रोस्कोपी के उपयोग से उच्च कंट्रास्ट और उच्च रिज़ॉल्यूशन दोनों प्राप्त होते हैं।

गाल कोशिकाएं त्वरित अध्ययन करती हैं। टूथपिक से मुंह के अंदर के हिस्से को धीरे से खुरचकर और एक स्लाइड पर कोशिकाओं को पतला फैलाकर बुक्कल कोशिकाएं प्राप्त की जाती हैं, तैयारी के ऊपर एक कवर स्लिप रखी जाती है जिसे सूखने नहीं दिया जाता है। इन कोशिकाओं में कोई अंतर्निहित कंट्रास्ट नहीं होता है और इन्हें ब्राइटफील्ड के साथ देखना मुश्किल होता है। एक डार्कफील्ड माइक्रोस्कोप में नाटकीय विपरीतता हासिल की जाती है, नाभिक और अन्य इंट्रासेल्युलर समावेशन के साथ-साथ आसपास के माध्यम में बैक्टीरिया को आसानी से स्थित और पहचाना जा सकता है (चित्र 2डी)।


चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का कार्य सिद्धांत

फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी इस सिद्धांत पर आधारित है कि किसी वस्तु के विभिन्न भागों की मोटाई और अपवर्तनांक में अंतर से प्रेरित प्रकाश किरणों में छोटे चरण परिवर्तन, चमक या प्रकाश की तीव्रता में अंतर में परिवर्तित हो सकते हैं।

सरल शब्दों में, चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का अनुवाद है अदृश्य चरण बदलाव में तीव्रता के दृश्य अंतर। मानव आंखों के लिए चरण परिवर्तन का पता नहीं लगाया जा सकता है जबकि चमक या प्रकाश की तीव्रता को मानव आंखों से आसानी से पता लगाया जा सकता है।

चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल घटक

फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप अपनी ऑप्टिकल संरचना में एक साधारण यौगिक माइक्रोस्कोप के समान है। एक सामान्य सूक्ष्मदर्शी के समान, इसमें एक प्रकाश स्रोत, संघनित्र प्रणाली, वस्तुनिष्ठ लेंस प्रणाली और नेत्र लेंस प्रणाली होती है।

एक फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप होने में सामान्य माइक्रोस्कोप से अलग होता है दो अतिरिक्त घटक:

(1). उप-चरण कुंडलाकार डायाफ्राम

(2). चरण प्लेट

(1). उप-चरण कुंडलाकार डायाफ्राम

यह सूक्ष्मदर्शी के उप-चरण संघनित्र के नीचे स्थित होता है। उप-चरण कुंडलाकार डायाफ्राम a . बनाने में मदद करता है संकीर्ण, खोखला शंकु या प्रकाश का वलय वस्तु को रोशन करने के लिए।

(2). चरण प्लेट

फेज प्लेट को विवर्तन प्लेट या फेज रिटार्डेशन प्लेट भी कहा जाता है। यह ऑब्जेक्टिव लेंस के बैक फोकल प्लेन पर स्थित होता है। इस प्लेट पर फेज रिटार्डिंग घटकों को लेपित किया जाता है। चरण प्लेट एक या कुछ चैनलों के साथ एक पारदर्शी ग्लास डिस्क है। चैनल एक ऐसी सामग्री के साथ लेपित है जो प्रकाश को अवशोषित कर सकता है लेकिन इसे मंद नहीं कर सकता। फेज प्लेट का दूसरा भाग (चैनल के अलावा) मैग्नीशियम फ्लोराइड जैसे प्रकाश मंदक सामग्री के साथ लेपित है। फेज प्लेट घटना प्रकाश के चरण को कम करने में मदद करती है।

चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी में कंट्रास्ट कैसे बनाया जाता है?

बिना दाग वाली कोशिकाएं सामान्य माइक्रोस्कोप के तहत कंट्रास्ट नहीं बना सकती हैं। हालांकि, जब रोशनी एक बिना दाग वाली सेल से गुजरती है, तो यह कोशिकाओं में विभिन्न अपवर्तक सूचकांक और मोटाई वाले क्षेत्रों का सामना करती है। जब प्रकाश किरणें उच्च अपवर्तनांक वाले क्षेत्र से गुजरती हैं, तो यह अपने सामान्य पथ से विचलित हो जाती है और ऐसी प्रकाश किरण चरण परिवर्तन या चरण मंदता का अनुभव करती है। कम अपवर्तनांक वाले क्षेत्र से गुजरने वाली प्रकाश किरणें अविचलित रहती हैं (कोई प्रावस्था परिवर्तन नहीं)।

मंद और गैर-मंद प्रकाश किरणों के बीच के चरणों में अंतर लगभग है ¼ मूल तरंग लंबाई (यानी, /4) मानव आंखें हैं नहीं प्रकाश के चरण में इस मिनट के परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम और इस प्रकार, इस तरह के छोटे चरण परिवर्तन छवि में कोई विपरीतता पैदा नहीं करते हैं। फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप में विशेष उपकरण (कुंडलाकार डायाफ्राम और फेज प्लेट) होते हैं, जो इन मिनट चरण परिवर्तनों को आयाम परिवर्तन या चमक परिवर्तन में परिवर्तित करते हैं ताकि अंतिम छवि में एक विपरीत अंतर बनाया जा सके। यह कंट्रास्ट अंतर हमारी आंखों से आसानी से पता लगाया जा सकता है।

आइए देखें कि कैसे फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप ऑब्जेक्ट को धुंधला किए बिना छवि में कंट्रास्ट प्राप्त करता है। फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप में, कंट्रास्ट प्राप्त करने के लिए, विवर्तित तरंगों को सीधी तरंगों से अलग करना पड़ता है। यह पृथक्करण उप-चरण कुंडलाकार डायाफ्राम द्वारा प्राप्त किया जाता है।

कुंडलाकार डायाफ्राम प्रकाश के खोखले शंकु के साथ नमूने को रोशन करता है। कुछ किरणें (प्रत्यक्ष किरणें) नमूने के पतले क्षेत्र से गुजरती हैं और किसी भी मंदता से नहीं गुजरती हैं और वे सीधे वस्तुनिष्ठ लेंस में प्रवेश करती हैं। नमूने के सघन क्षेत्र से गुजरने वाली प्रकाश किरणों को माना जाता है और वे अविभाजित किरणों की तुलना में विलंबित चरण के साथ चलती हैं। प्रकाश की प्रावस्था की मंदता लगभग होती है ¼ का मैं घटना प्रकाश की। मंद और अमंद प्रकाश दोनों को अंतिम छवि बनाने के लिए उद्देश्य के पिछले फोकल तल पर रखी गई फेज प्लेट से गुजरना पड़ता है।

फेज प्लेट को इस तरह से डिजाइन और तैनात किया गया है कि मंद प्रकाश किरणें फेज प्लेट के उस क्षेत्र से गुजरेंगी जहां प्रकाश मंदक सामग्री लेपित होती है। जब ¼ (या /4) मंद प्रकाश चरण प्लेट के इस क्षेत्र के माध्यम से पारित किया जाता है, इसे ¼ (या λ/4) द्वारा और मंद कर दिया जाता है। इसके साथ ही अंतिम परिवर्तन या मंदता होगी- + = ½λ (या /4 + λ/4 = /2)। गैर-मंदित किरणें फेज प्लेट के चैनलों से गुजरेंगी और उनके चरण में फेज प्लेट द्वारा कोई बदलाव नहीं किया जाएगा।

जब मंदबुद्धि और ½λ (या λ/2) मंद प्रकाश को पुनः संयोजित किया जाता है (फोकल बिंदु पर), a नकारात्मक या विनाशकारी हस्तक्षेप बनाया गया है क्योंकि क्रेस्ट तथा गर्त मंद और मंद प्रकाश किरणें एक दूसरे को रद्द कर देंगी। विनाशकारी हस्तक्षेप के साथ, एक उज्ज्वल पृष्ठभूमि के खिलाफ नमूने की छवि गहरा दिखाई देती है। दूसरी ओर, यदि सामग्री के संबंध में बिना विचलित प्रकाश किरणों को चरण के माध्यम से पारित किया जाता है, तो दो किरणें एक ही चरण में होंगी और परिणाम होगा सकारात्मक या रचनात्मक हस्तक्षेप. रचनात्मक हस्तक्षेप में, एक अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ नमूने की छवि उज्जवल हो जाती है। इस प्रकार चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी में, विनाशकारी और रचनात्मक हस्तक्षेपों का संयोजन अंतिम छवि में उच्च विपरीतता पैदा करता है।

चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के अनुप्रयोग

आवर्धन और विभेदन चरण विपरीत सूक्ष्मदर्शी एक साधारण सूक्ष्मदर्शी के समान है। फिर भी, जैविक विज्ञान में पीसीएम के कई अनुप्रयोग हैं। चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के अनुप्रयोगों को संक्षेप में प्रस्तुत किया जा सकता है:

पीसीएम जीवित कोशिकाओं के दृश्य को सक्षम बनाता है।

यह बिना दाग वाली कोशिकाओं के दृश्य को सक्षम बनाता है।

पीसीएम का उपयोग विभिन्न सेल ऑर्गेनेल (माइटोकॉन्ड्रिया, न्यूक्लियस और वैक्यूल्स) को देखने के लिए किया जा सकता है।

कोशिकीय घटनाओं जैसे कोशिका विभाजन, फैगोसाइटोसिस, साइक्लोसिस आदि का अध्ययन करने में मदद करता है।

क्रोमोसोमल और फ्लैगेलर आंदोलनों जैसे सभी प्रकार के सेलुलर आंदोलनों की कल्पना करने के लिए प्रयुक्त होता है।

कोशिका विभाजन, फैगोसाइटोसिस आदि के दौरान साइटोस्केलेटन गतिकी के अध्ययन को सक्षम बनाना।

कोशिकाओं और विभिन्न जीवों की झिल्ली पारगम्यता के अध्ययन को सक्षम करें।

चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का व्यापक रूप से ऊतक संवर्धन में जीवित कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए उनके विकास की निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है

चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के लाभ

बिना दाग वाली कोशिकाओं की स्पष्ट छवि प्रदान करें।

रासायनिक तैयारी और धुंधलापन के कारण कोशिकाओं के नुकसान से बचें।

कोशिकाओं के बारीक विवरण को हाइलाइट करते हुए उच्च कंट्रास्ट छवियां प्रदान करें।

ऑप्टिकल निर्माण अपेक्षाकृत सरल है।

एक यौगिक सूक्ष्मदर्शी को मामूली परिवर्धन के साथ चरण विपरीत सूक्ष्मदर्शी तक ऊंचा किया जा सकता है।

कोशिकाओं की व्यवहार्यता खोए बिना जीवित कोशिकाओं के लंबे समय तक अवलोकन को सक्षम करें।

लाइव सेल इमेजिंग और लाइव प्रोसेस मॉनिटरिंग संभव है।

चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के नुकसान / सीमाएं

फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप छवियों के चारों ओर एक उज्ज्वल प्रभामंडल बनाता है। प्रभामंडल का निर्माण प्रत्यक्ष और विचलित किरणों के आंशिक या अपूर्ण पृथक्करण के कारण होता है।

पीसीएम केवल व्यक्तिगत कोशिकाओं या कोशिकाओं की पतली परत को देखने के लिए उपयोगी है।

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कंपाउंड माइक्रोस्कोप का कार्य सिद्धांत

यौगिक सूक्ष्मदर्शी इस सिद्धांत पर कार्य करते हैं कि जब आवर्धित किए जाने वाले एक छोटे नमूने को उसके वस्तुनिष्ठ लेंस के फोकस के ठीक बाहर रखा जाता है, तो वस्तु की एक आभासी, उलटी और अत्यधिक आवर्धित छवि आंख से अलग दृष्टि की कम से कम दूरी पर बनती है। नेत्रिका के पास रखा।

यौगिक सूक्ष्मदर्शी का वर्गीकरण

कंपाउंड माइक्रोस्कोप को दो श्रेणियों में वर्गीकृत किया गया है

1. लाइट माइक्रोस्कोप

प्रकाश सूक्ष्मदर्शी को आगे चार श्रेणियों में वर्गीकृत किया गया है जैसे

  1. ब्राइट-फील्ड माइक्रोस्कोप
  2. डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोप।
  3. चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप।
  4. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप।

2. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप को आगे तीन श्रेणियों में वर्गीकृत किया गया है जैसे

1. लाइट माइक्रोस्कोप

प्रकाश सूक्ष्मदर्शी दृश्य प्रकाश और आवर्धक लेंस का उपयोग उन छोटी वस्तुओं की जांच करने के लिए करते हैं जो नग्न आंखों को दिखाई नहीं देती हैं, या नग्न आंखों की तुलना में बेहतर विवरण में हैं। हालाँकि, माइक्रोस्कोपी में आवर्धन सबसे महत्वपूर्ण मुद्दा नहीं है।

उन्हें इन निम्नलिखित समूहों में वर्गीकृत किया गया है

ए। ब्राइट-फील्ड माइक्रोस्कोप

एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप में, नमूना उज्ज्वल पृष्ठभूमि के खिलाफ अंधेरे के रूप में दिखाई देता है।

अनुप्रयोग:

सूक्ष्मजीवों की बाहरी संरचना का अध्ययन करने के लिए इनका प्रयोग प्रयोगशाला में किया जाता है।

बी। डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोप:

डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोप में, नमूना एक अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ उज्ज्वल दिखाई देता है।

अनुप्रयोग:

इस सूक्ष्मदर्शी का उपयोग बिना दाग वाली, पतली जीवित कोशिकाओं को भेद करने के लिए किया जाता है जो एक साधारण सूक्ष्मदर्शी के नीचे दिखाई नहीं देती हैं।

सी। चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप:

कुछ अवर्णित जीवित कोशिकाएं प्रकाश सूक्ष्मदर्शी में दिखाई नहीं देती हैं क्योंकि यह कोशिकाओं और पानी के बीच अंतर नहीं पैदा कर सकती हैं। केवल चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप सेल और पानी के बीच विपरीत अंतर पैदा कर सकता है, यही कारण है कि ये कोशिकाएं केवल चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप में दिखाई देती हैं

आवेदन:

सूक्ष्मजीवों के आकार और गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए उपयोग करें।

डी ।फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप:

इस प्रकार में, नमूना फ्लोरोसेंट रंगों से सना हुआ है और फिर पराबैंगनी किरणों (यूवी) के संपर्क में है। फ्लोरोसेंट रंग कम तरंग दैर्ध्य प्रकाश को अवशोषित करेंगे और उत्तेजित हो जाएंगे, परिणामस्वरूप वे एक उच्च तरंग दैर्ध्य प्रकाश जारी करेंगे। इस तंत्र का उपयोग करके फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप काम करते हैं।

आवेदन:

रोगजनकों की पहचान के लिए चिकित्सा प्रयोगशालाओं में उपयोग करें। विशिष्ट प्रोटीन के स्थानीयकरण के लिए भी उपयोग किया जाता है।

2. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप रोशनी के स्रोत के रूप में इलेक्ट्रॉनों का उपयोग करते हैं। इसमें प्रकाश सूक्ष्मदर्शी की तुलना में उच्च संकल्प शक्ति होती है।

विभिन्न प्रकार के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप मौजूद हैं जैसे

ए। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM)

इस प्रकार का इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप सतह को स्कैन करके इलेक्ट्रॉनों के एक केंद्रित बीम के साथ एक नमूने की एक छवि तैयार करता है। इलेक्ट्रॉन नमूने में परमाणुओं के साथ बातचीत करते हैं, विभिन्न संकेतों का उत्पादन करते हैं जिनमें सतह स्थलाकृति और नमूने की संरचना के बारे में जानकारी होती है।

आवेदन:

सूक्ष्मजीवों के सतह क्षेत्र का विस्तार से अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है।

बी। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम)

इस माइक्रोस्कोप में, एक छवि बनाने के लिए इलेक्ट्रॉन बीम को एक नमूने के माध्यम से पारित किया जाता है। टीईएम के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला नमूना 20 से 100 एनएम मोटा होना चाहिए।

आवेदन:

यह एक नमूने की आंतरिक संरचना का अध्ययन करता था।

सी। संनाभि माइक्रोस्कोपी

कन्फोकल माइक्रोस्कोप को कन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) या लेजर कन्फोकल स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (एलसीएसएम) के रूप में भी जाना जाता है।

यह एक ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक है जो छवि निर्माण में आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश को अवरुद्ध करने के लिए एक स्थानिक पिनहोल का उपयोग करके एक माइक्रोग्राफ के ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन और कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए है।

यह माइक्रोस्कोप एक नमूने में अलग-अलग गहराई पर कई द्वि-आयामी छवियों को कैप्चर करना एक वस्तु के भीतर त्रि-आयामी संरचनाओं (एक प्रक्रिया जिसे ऑप्टिकल सेक्शनिंग के रूप में जाना जाता है) के पुनर्निर्माण में सक्षम बनाता है।

आवेदन

कन्फोकल माइक्रोस्कोपी का व्यापक रूप से वैज्ञानिक और औद्योगिक समुदायों में उपयोग किया जाता है और विशिष्ट अनुप्रयोग जीवन विज्ञान, अर्धचालक निरीक्षण और सामग्री विज्ञान में होते हैं।


माइक्रोस्कोपी – विषय-सूची

माइक्रोस्कोपी की परिभाषा

यह दो ग्रीक शब्दों से बना है, यानी मिक्रोस का अर्थ है छोटा और स्कोपो का अर्थ है देखना या देखना। विज्ञान की वह शाखा जो सूक्ष्मदर्शी के उपयोग से विभिन्न कोशिकाओं और ऊतकों को देखने से संबंधित है जो नग्न आंखों के लिए अदृश्य हैं, माइक्रोस्कोपी कहलाती है।

माइक्रोस्कोपी का इतिहास

माइक्रोस्कोपी से जुड़ी शब्दावली

1. आवर्धन: यह किसी वस्तु के सूक्ष्मदर्शी से देखने पर प्रतीत होने वाले विस्तार का माप है।
2. संकल्प: इसे दो बिंदुओं के बीच सबसे छोटी दूरी के रूप में परिभाषित किया जा सकता है जिसे अलग-अलग संस्थाओं के रूप में पहचाना जा सकता है। मान जितना छोटा होगा, माइक्रोस्कोप का रिज़ॉल्यूशन उतना ही अधिक होगा और छवियों का विवरण बेहतर स्पष्टता के साथ देखा जा सकता है।
3. माइक्रोग्राफी: सूक्ष्मदर्शी द्वारा फोटोग्राफ लेने के क्षेत्र को कहते हैं माइक्रोग्राफी.

माइक्रोस्कोप की संकल्प शक्ति की गणना करने का सूत्र

लेंस की विभेदन क्षमता की गणना निम्न सूत्र का उपयोग करके की जा सकती है:

(varepsilon = 0.61 imes frac<<< m>< m<.A>>< m<.>>>>) (रेले सूत्र)
(lambda :)तरंगदैर्घ्य
(< m>< m<.55mu m>>) का उपयोग दृश्य प्रकाश के लिए किया जाता है
N.A.: ऑब्जेक्टिव लेंस N.A.

प्रकाश या ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी

जब माइक्रोस्कोप में क्षेत्र को रोशन करने के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला प्रकाश स्रोत होता है सफेद रोशनी (दृश्यमान प्रकाश)), यह कहा जाता है हल्की माइक्रोस्कोपी. सफेद प्रकाश जैविक नमूने के माध्यम से प्रेषित या परावर्तित होता है और फिर आने वाली रोशनी पर्यवेक्षक तक पहुंचने के लिए लेंस की एक या श्रृंखला के माध्यम से गुजरती है। प्रकाश सूक्ष्मदर्शी मुख्य रूप से दो प्रकार के सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करता है, अर्थात् सरल सूक्ष्मदर्शी और यौगिक सूक्ष्मदर्शी।

सरल माइक्रोस्कोप

परिभाषा: सरल सूक्ष्मदर्शी एकल-लेंस सूक्ष्मदर्शी होते हैं, जिन्हें कभी-कभी विदारक सूक्ष्मदर्शी भी कहा जाता है।

  1. लेंस का इस्तेमाल किया: इसमें एक छोटी फोकल लंबाई के साथ एक डबल उत्तल लेंस के साथ एक आवर्धक कांच है।
  2. सिद्धांत: एक साधारण सूक्ष्मदर्शी इस सिद्धांत पर काम करता है कि जब एक छोटी वस्तु को उत्तल लेंस की फोकल लंबाई के भीतर रखा जाता है, तो यह एक आभासी, सीधा और आवर्धित छवि देता है।
  3. आवर्धन: लेंस का आवर्धन उसकी फोकस दूरी पर निर्भर करता है और यह सामान्यतः संयुक्त सूक्ष्मदर्शी से छोटा होता है।

सरल या विदारक सूक्ष्मदर्शी का आरेख

यौगिक सूक्ष्मदर्शी

परिभाषा: यौगिक सूक्ष्मदर्शी दोहरे लेंस वाले सूक्ष्मदर्शी होते हैं। दो लेंसों को ऑब्जेक्टिव लेंस और ऐपिस कहा जाता है। इसे आमतौर पर एक छात्र माइक्रोस्कोप के रूप में जाना जाता है।

  1. लेंस का इस्तेमाल किया: एक संयुक्त सूक्ष्मदर्शी दो उत्तल लेंसों का उपयोग करता है, एक ऐपिस में और दूसरा उद्देश्य में। ऐपिस लेंस उनकी फोकल लंबाई के साथ भिन्न होते हैं और इसलिए आवर्धन भी भिन्न होते हैं। एक छात्र सूक्ष्मदर्शी (< m<10 x, 40 x>>) और (< m<100x>>) की आवर्धक शक्ति के साथ तीन वस्तुनिष्ठ लेंसों के साथ आता है, जबकि ऐपिस की आवर्धन शक्ति (< हो सकती है) m<5x, 10x, 15x, 20x>>) और (< m<30x>>)
  2. सिद्धांत: ऑब्जेक्टिव लेंस नमूने से बिखरा हुआ प्रकाश प्राप्त करता है, जबकि ऐपिस का उपयोग छवि के अंतिम अवलोकन के लिए किया जाता है। यह एक आभासी, सीधा और बड़ा प्रतिबिम्ब देता है।
  3. आवर्धन: लेंस का आवर्धन उसकी फोकस दूरी पर निर्भर करता है और यह सामान्य सूक्ष्मदर्शी से अधिक होता है।

यौगिक या छात्र माइक्रोस्कोप का आरेख

यौगिक सूक्ष्मदर्शी के भाग

एक विशिष्ट यौगिक सूक्ष्मदर्शी में निम्नलिखित भाग होते हैं:

  • 1. सिर / शरीर: यह सूक्ष्मदर्शी का ऊपरी भाग होता है। सूक्ष्मदर्शी के शरीर में निम्नलिखित भाग होते हैं:
    • (ए) ऐपिस: इसे ऑक्यूलर लेंस भी कहते हैं। यह मेटल ट्यूब के ऊपरी सिरे पर मौजूद लेंस है। मोनोकुलर मॉडल में एक ट्यूब होती है जबकि दूरबीन मॉडल में दो ट्यूब होती हैं, प्रत्येक में एक ऐपिस होती है। दो ट्यूबों के बीच की दूरी को दूरी के अनुसार समायोजित किया जा सकता है
    • (बी) ऐपिस ट्यूब: यह एक धातु ट्यूब है, (160,< m>) ((6.3) इंच) लंबा। यह लंबाई मानव आंखों के संकल्प पर आधारित है और विपथन को कम करने के लिए डिज़ाइन की गई है।
    • (सी) उद्देश्य लेंस: ये माइक्रोस्कोप पर प्राथमिक लेंस हैं।
    • (डी) नोजपीस: वस्तुनिष्ठ लेंस धारण करता है, इसमें एक परिक्रामी गति होती है ताकि नमूने का सामना करने के लिए एक विशेष उद्देश्य का चयन किया जा सके।
    • (डी) मोटे और ठीक फोकस नॉब्स: छवि पर ध्यान केंद्रित करने के लिए उनका उपयोग बॉडी ट्यूब को स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है। मोटे नॉब्स का इस्तेमाल इमेज के रफ फोकसिंग के लिए किया जाता है, जबकि फाइन फोकस नॉब्स का इस्तेमाल किसी भी ब्लर फोकस को हटाने के लिए किया जाता है और ये पूरी तरह से आंख की रिजॉल्यूशन पावर पर आधारित होते हैं।
    • (ई) चरण: यह एक सपाट मंच है जहां एक नमूना लगाया जाता है। यह एक यांत्रिक चरण है और बेहतर रोशनी के लिए हल्की हलचल संभव है।
    • (च) स्टेज क्लिप्स: स्लाइड को स्थिति में मजबूती से पकड़ें और नमूने के विभिन्न क्षेत्रों को देखने के लिए उंगलियों की हरकतें की जाती हैं।
    • (जी) एपर्चर: यह वह छेद है जिसके माध्यम से प्रेषित प्रकाश चरण तक पहुंचता है और बदले में नमूना लेता है।
    • (ज) आइरिस डायाफ्राम: नमूने तक पहुंचने वाले प्रकाश की मात्रा को नियंत्रित करें। यह आवश्यक है क्योंकि अलग-अलग नमूनों को तेज कंट्रास्ट प्राप्त करने और बेहतर रिज़ॉल्यूशन के साथ देखने के लिए अलग-अलग मात्रा में प्रकाश की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, आईरिस डायाफ्राम प्रकाश की मात्रा को नियंत्रित करके बेहतर कंट्रास्ट प्राप्त करने में मदद करता है।
    • (i) कंडेनसर: यह डायाफ्राम के नीचे स्थित होता है और नमूने पर प्रकाश केंद्रित करने के लिए ऊपर और नीचे ले जाया जा सकता है।
    • (ए) प्रकाशक: यदि मौजूद है, तो आमतौर पर एक कम वोल्टेज हलोजन लैंप होता है। लेकिन कई मॉडल प्राकृतिक प्रकाश का भी उपयोग करते हैं और दर्पण का उपयोग करके एपर्चर की ओर निर्देशित होते हैं।

    कंपाउंड माइक्रोस्कोप की कार्य प्रक्रिया

    एक नमूना को माउंट करने और एक मिश्रित माइक्रोस्कोप के साथ उसका निरीक्षण करने की प्रक्रिया इस प्रकार है:
    1. एक जैविक नमूना ग्लिसरीन या पानी में डूबी एक पारदर्शी कांच की स्लाइड पर लगाया जाता है और एक कवरस्लिप से ढका होता है।
    2. इस तरह की तैयार स्लाइड को फिर कंडेनसर और ऑब्जेक्टिव लेंस के बीच के मंच पर रखा जाता है।
    3. एक परावर्तक दर्पण और कंडेनसर का उपयोग करके दृश्य प्रकाश की किरण नमूने पर केंद्रित होती है।
    4. प्रकाश की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए आईरिस एपर्चर को भी समायोजित किया जा सकता है।
    5. आवश्यक आवर्धन के आधार पर एक वस्तुनिष्ठ लेंस (परिक्रामी नोजपीस पर स्थिर) चुना जाता है। एक (< m<100x>>) वस्तुनिष्ठ लेंस के लिए नमूने पर एक तेल विसर्जन की आवश्यकता होती है।
    6. तब ऑब्जेक्टिव लेंस नमूने के माध्यम से प्रकाश को उठाता है और एक पर्यवेक्षक ऐपिस के माध्यम से छवि को देख सकता है
    7. छवि के आवर्धन और संकल्प के आधार पर, एक स्पष्ट छवि प्राप्त करने के लिए एक मोटे और ठीक समायोजन घुंडी का उपयोग किया जा सकता है।
    8. यदि तेल विसर्जन का उपयोग किया जाता है, तो वस्तुनिष्ठ लेंस, नमूना और मंच को एक सूती कपड़े से साफ करना होगा।

    सरल और यौगिक माइक्रोस्कोप के बीच अंतर

    सरल माइक्रोस्कोपयौगिक सूक्ष्मदर्शी
    (1)एकल लेंस का उपयोग करता हैदो लेंस प्रणाली का उपयोग करता है
    (2)केवल एक लेंस मौजूद है(3) से (5) उद्देश्य मौजूद हैं और एक या दो ऐपिस लेंस मौजूद हैं
    (3)आवर्धन उपयोग किए गए एकल लेंस तक सीमित हैआवर्धन ऐपिस और ऑब्जेक्टिव लेंस के आवर्धन का गुणन है
    (4)संघनित्र लेंस अनुपस्थित होता हैनमूने में प्रवेश करने वाले प्रकाश की तीव्रता को नियंत्रित करने के लिए कंडेनसर लेंस का उपयोग किया जाता है
    (5)मोटे समायोजन बहुत सीमित हैं जबकि ठीक समायोजन संभव नहीं हैस्पष्ट छवि के लिए मोटे और बारीक समायोजन अच्छे हैं और समाक्षीय घुंडी के साथ किए गए हैं
    (6)प्रकाश स्रोत प्राकृतिक हैप्रकाश स्रोत प्राकृतिक या कृत्रिम हो सकता है (हलोजन बल्ब)
    (7)दर्पण अवतल है, परावर्तक प्रकारदर्पण एक तरफ समतल है और दूसरी तरफ अवतल है

    प्रकाश माइक्रोस्कोपी की तकनीक

    प्रकाश माइक्रोस्कोपी या ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी में कई तकनीकों का विकास आवश्यक कंट्रास्ट या नमूने के हिस्से को हाइलाइट करने के आधार पर विकसित किया गया है। ये सभी वेरिएंट विशिष्ट उद्देश्यों के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। उनमें से कुछ हैं:

    ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी: सामान्य छात्र सूक्ष्मदर्शी या प्रकाश सूक्ष्मदर्शी को ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप कहा जाता है क्योंकि छवि एक चमकदार रोशनी वाले क्षेत्र के खिलाफ बनाई जाती है।

    • 1. नमूना परिवेश की तुलना में सघन और कुछ अपारदर्शी है।
    • 2. ऐसे नमूने से गुजरने वाला प्रकाश अवशोषित हो जाता है।
    • 3. ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग संरक्षित, दाग या जीवित जैविक नमूनों को देखने के लिए किया जाता है।
    • 4. इस सरल प्रकार की माइक्रोस्कोपी के फायदे संभालने में आसानी और न्यूनतम नमूना तैयार करना है।
    • 5. नुकसान यह है कि संकल्प कम रहता है।

    डार्क फील्ड माइक्रोस्कोपी: ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी में, डार्क फील्ड तकनीक का उपयोग बिना दाग वाले नमूने में कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए किया जाता है।

    • 1. सीधे प्रेषित प्रकाश को कम से कम किया जाता है और इसके बजाय, नमूने द्वारा बिखरे हुए प्रकाश का उपयोग छवि बनाने के लिए किया जाता है।
    • 2. यह चमकदार वस्तुओं के साथ क्लासिक अंधेरे, लगभग काले रंग की पृष्ठभूमि का उत्पादन करता है और इसलिए नाम डार्क फील्ड माइक्रोस्कोपी.
    • 3. इसका उपयोग जीवित नमूनों को देखने के लिए किया जा सकता है।

    चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी: जैविक नमूनों में, कोशिका या कोशिका के कुछ हिस्सों और आसपास के माध्यम के अपवर्तनांक (आरआई) के बीच थोड़ा अंतर होता है, जो इसके फोकस और संकल्प को सीमित करता है। इस अंतर का उपयोग चरण-विपरीत सूक्ष्मदर्शी में किया जाता है।

    • 1. नमूना द्वारा विवर्तित प्रकाश और परिवेश से विवर्तित प्रकाश के बीच चरण अंतर का उपयोग चमक भिन्नताएं बनाने के लिए किया जाता है।
    • 2. यह विशेष रूप से एक नाभिक की तरह कोशिका संरचनाओं को देखने के लिए उपयोग किया जाता है, जो अन्यथा उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी में अदृश्य हैं।
    • 3. चरण-विपरीत सूक्ष्मदर्शी ने जीव विज्ञानियों के लिए कोशिका विभाजन के दौरान कोशिकाओं की तरह जीवित कोशिकाओं का अध्ययन करना संभव बना दिया।

    हस्तक्षेप माइक्रोस्कोपी: इंटरफेरेंस माइक्रोस्कोपी एक प्रिज्म का उपयोग प्रकाश को दो अलग-अलग विचलन वाले बीमों में विभाजित करने के लिए करता है जो तब नमूने से गुजरते हैं।

    • 1. इस प्रकार यह दो बीमों के पुनर्संयोजन पर अपवर्तनांक में अंतर को मापने पर आधारित है।
    • 2. हस्तक्षेप तब होता है जब एक प्रकाश किरण दूसरे के सापेक्ष मंद या उन्नत होती है।
    • 3. हस्तक्षेप माइक्रोस्कोपी चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी से बेहतर है।

    प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी: इस प्रकार की माइक्रोस्कोपी प्रतिदीप्त करने वाले नमूने/नमूनों का उपयोग करती है।

    • 1. एक तरंग दैर्ध्य के प्रकाश का उपयोग नमूने को रोशन करने के लिए किया जाता है और नमूने से निकलने वाले प्रकाश का उपयोग छवि बनाने के लिए किया जाता है।
    • 2. कोशिकाओं या कोशिकाओं के भागों को फ्लोरोसेंट रंगों से लेबल किया जाता है।
    • 3. इस पद्धति का उपयोग आधुनिक जीवन विज्ञान अध्ययनों में किया जाता है क्योंकि यह अत्यधिक संवेदनशील है जिससे एकल अणुओं का भी पता लगाया जा सकता है।

    ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी: ये पारंपरिक सूक्ष्मदर्शी हैं लेकिन ध्रुवीकरण प्रकाश का उपयोग करने के लिए एक अतिरिक्त विशेषता है।

    • 1. एक ध्रुवीकरण फिल्टर मौजूद है जो प्रकाश को ध्रुवीकृत करने और फिर वस्तु को रोशन करने की अनुमति देता है।
    • 2. यदि वस्तु द्विभाजित है, तो यह प्रकाश को अलग-अलग ध्रुवीकरणों के साथ दो बीमों में विभाजित करती है।
    • 3. ऐपिस के नीचे लगा फिल्टर एक को छोड़कर सभी ध्रुवीकृत प्रकाश को अवरुद्ध कर देता है।
    • 4. बेहतर छवि के लिए अधिकतम कंट्रास्ट प्राप्त करने के लिए विश्लेषक को घुमाया जा सकता है।
    • 5. इस प्रकार की माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं में देशी आणविक संरचनाओं के उन्मुखीकरण को निर्धारित करने और जीवों के प्रारंभिक विकास चरणों का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है

    अन्य प्रकार के माइक्रोस्कोप

    1.इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप: एक प्रकाश माइक्रोस्कोप और एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के बीच मूल अंतर यह है कि एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप दृश्य प्रकाश के बजाय इलेक्ट्रॉनों के बीम का उपयोग करता है। इलेक्ट्रॉनों में दृश्य प्रकाश की तुलना में बहुत कम तरंग दैर्ध्य होते हैं, और यह इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी को मानक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी की तुलना में उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों का उत्पादन करने की अनुमति देता है।

    2. उपकोशिकीय संरचनाएं और उनके विवरण स्पष्ट रूप से देखे जा सकते हैं।

    3. इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी का मुख्य नुकसान यह है कि जीवित कोशिकाओं को नहीं देखा जा सकता है क्योंकि नमूनों को एक व्यापक निर्धारण प्रक्रिया के माध्यम से तैयार किया जाना है।

    4. इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी दो प्रमुख प्रकार के होते हैं-स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी (SEM) और संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी

    (ए) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम): इलेक्ट्रॉनों का एक बीम एक सेल या ऊतक की सतह को आगे और पीछे ले जाता है और एक बहुत अच्छा (< m<3D>>) दृश्य देता है। (2011) में SEM का सबसे अच्छा रिज़ॉल्यूशन (0.4,< m . था>)

    (बी) ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम): नमूने को बहुत पतले स्लाइस में काट दिया जाता है और इलेक्ट्रॉनों की किरण नमूने के माध्यम से चलती है। टीईएम का उपयोग सेलुलर ऑर्गेनेल की संरचनाओं को जानने के लिए किया जाता है।

    5. इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी प्रकाश सूक्ष्मदर्शी की तुलना में भारी, भारी और बहुत महंगे होते हैं। इसके अलावा, नमूना तैयार करना एक व्यापक और समय लेने वाली प्रक्रिया है।

    पराबैंगनी (यूवी) सूक्ष्मदर्शी: यह नमूनों की रोशनी के लिए पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करता है। पराबैंगनी विकिरणों में दृश्य प्रकाश की तुलना में बहुत कम तरंग दैर्ध्य होते हैं और बहुत उच्च-रिज़ॉल्यूशन वाली छवियां प्राप्त की जा सकती हैं। इस प्रकार की माइक्रोस्कोपी विशेष रूप से प्रोटीन क्रिस्टल के विकास को जानने के लिए उपयोगी है।

    इन्फ्रारेड सूक्ष्मदर्शी: इन्फ्रारेड वेवलेंथ का उपयोग करके की जाने वाली माइक्रोस्कोपी को इंफ्रारेड माइक्रोस्कोपी कहा जाता है। यह अनुसंधान, उद्योग में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और अनुप्रयोगों में से एक नागरिक और आपराधिक मामलों के फोरेंसिक में है। इसका उपयोग यह पता लगाने के लिए किया जाता है कि दो नमूने समान हैं या नहीं।

    कन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप: विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मदर्शी में लेजर रोशनी स्रोतों का उपयोग किया जाता है। यह एक उभरता हुआ क्षेत्र है। कन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है जहां (< m<3D>>) संरचनाएं महत्वपूर्ण होती हैं।

    माइक्रोस्कोपी का महत्व

    माइक्रोस्कोपी का महत्व इस प्रकार है:


    1. माइक्रोस्कोपी के जीव विज्ञान और चिकित्सा में व्यापक अनुप्रयोग हैं।
    2. इसका उपयोग मुख्य रूप से ऊतक और सेलुलर स्तरों पर संरचनाओं को जानने के लिए किया जाता है।
    3. विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके उप-कोशिकीय संरचनाओं का भी पता लगाया जाता है।
    4. इन्फ्रारेड सूक्ष्मदर्शी का उपयोग यह पता लगाने के लिए किया जाता है कि दो नमूने समान हैं या नहीं।
    5. यूवी माइक्रोस्कोपी विशेष रूप से प्रोटीन क्रिस्टल के विकास को जानने के लिए उपयोगी है।
    6. डार्क फील्ड माइक्रोस्कोपी जीवित नमूनों का निरीक्षण करने के लिए उपयोगी है।
    7. कन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है जहां (< m<3D>>) संरचनाएं महत्वपूर्ण होती हैं।
    8. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग एकल-अणु स्तर पर संकेतों का पता लगाने के लिए किया जाता है।

    माइक्रोस्कोपी पर सारांश

    आज की वैज्ञानिक दुनिया में, सूक्ष्मदर्शी जैविक विज्ञान और चिकित्सा के क्षेत्र में आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला उपकरण है। इसका उपयोग सरल एककोशिकीय जीवों, विभिन्न जैविक ऊतकों से लेकर बहुत उच्च-रिज़ॉल्यूशन उप-कोशिकीय संरचनाओं तक किया जाता है। जैविक विज्ञान और चिकित्सा में माइक्रोस्कोपी के अनुप्रयोग बहुत बड़े हैं और यह क्षेत्र अपने आप में आकर्षक और मंत्रमुग्ध कर देने वाला है।

    कंट्रास्ट और संवेदनशीलता के लिए फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी में हालिया प्रगति ऐसी है कि वैज्ञानिक एकल-अणु स्तर पर संकेतों का पता लगाने में सक्षम हैं। इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी, हालांकि भारी और महंगे हैं, उच्च थ्रूपुट अध्ययनों में जहां आवर्धन के अत्यधिक स्तर की आवश्यकता होती है, की आवश्यकता होती है। आणविक इमेजिंग और सेल इमेजिंग नए buzzwords बन गए हैं। हिस्टोलॉजिकल तकनीकों में नई प्रगति, आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले रंग और दाग, और विभिन्न फ्लोरोक्रोम का विकास वैज्ञानिकों को हमारे आसपास के जीवित दुनिया को नए आवर्धन के साथ तलाशने में सक्षम बनाता है।

    अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न (एफएक्यू) पर माइक्रोस्कोपी

    प्रश्न १. माइक्रोस्कोपी क्या है?
    उत्तर:माइक्रोस्कोपी विज्ञान की वह शाखा है जो नग्न आंखों के लिए अदृश्य वस्तुओं को देखने के लिए विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करती है।

    प्रश्न 2. वूटोपी सूक्ष्मदर्शी के प्रकार हैं?
    उत्तर: विज्ञान में विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मदर्शी का उपयोग किया जाता है। एक मिश्रित प्रकाश सूक्ष्मदर्शी सबसे आम है। प्रकाश सूक्ष्मदर्शी, इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी, कन्फोकल लेजर सूक्ष्मदर्शी कुछ अन्य उदाहरण हैं।

    प्रश्न ३. माइक्रोस्कोपी किसके लिए प्रयोग किया जाता है?
    उत्तर:माइक्रोस्कोपी के जीव विज्ञान और चिकित्सा में व्यापक अनुप्रयोग हैं। इसका उपयोग मुख्य रूप से ऊतक और सेलुलर स्तरों पर संरचनाओं को जानने के लिए किया जाता है। विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके उप-कोशिकीय संरचनाओं का भी पता लगाया जाता है।

    प्रश्न 4. एक साधारण सूक्ष्मदर्शी का सिद्धांत क्या है?
    उत्तर:एक साधारण सूक्ष्मदर्शी इस सिद्धांत का उपयोग करता है कि जब किसी वस्तु को उसकी फोकस दूरी के भीतर रखा जाता है, तो वस्तु का एक आभासी, सीधा और आवर्धित प्रतिबिंब बनता है।

    प्रश्न ५. सूक्ष्मदर्शी के दो मुख्य प्रकार कौन से हैं?
    उत्तर: साधारण सिंगल-लेंस माइक्रोस्कोप और कंपाउंड या डबल लेंस माइक्रोस्कोप दो मुख्य प्रकार के प्रकाश सूक्ष्मदर्शी हैं।

    प्रश्न 6. सूक्ष्मदर्शी के (14) भाग क्या होते हैं?
    उत्तर: निम्नलिखित छवि एक संयुक्त सूक्ष्मदर्शी के सभी भागों को दिखाती है।

    प्रश्न ७. प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाने वाला सबसे सामान्य सूक्ष्मदर्शी कौन सा है?
    उत्तर:यौगिक सूक्ष्मदर्शी जिसे छात्र सूक्ष्मदर्शी भी कहा जाता है, प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाने वाला सबसे सामान्य सूक्ष्मदर्शी है।

    अब जब आपको माइक्रोस्कोपी पर सभी आवश्यक जानकारी प्रदान की गई है और हम आशा करते हैं कि यह विस्तृत लेख आपके लिए उपयोगी होगा। यदि आपके पास माइक्रोस्कोपी पर कोई प्रश्न हैं, तो हमें नीचे दिए गए कमेंट बॉक्स के माध्यम से पिंग करें और हम जल्द से जल्द आपसे संपर्क करेंगे।


    माइक्रोस्कोपी | चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी

    ज़र्निके चरण कंट्रास्ट

    ज़र्निक चरण कंट्रास्ट विधि अंधेरे क्षेत्र के समान है, सिवाय इसके कि प्रत्यक्ष (नॉनडिफ़्रेक्टेड) ​​प्रकाश का सापेक्ष चरण 90 ° से बदल जाता है, बल्कि समाप्त हो जाता है। व्यवहार में यह एक कुंडलाकार कंडेनसर एपर्चर और एक चरण रिंग ( चित्रा 2 ) के साथ एक उद्देश्य का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। चरण परिवर्तन ± 90° हो सकता है, जो सकारात्मक या नकारात्मक चरण कंट्रास्ट देता है। चरण की अंगूठी आमतौर पर केवल आंशिक रूप से संचारित होती है, जिसमें संवेदनशीलता को बढ़ाने का प्रभाव होता है। eqns [8] या [11] से, एक कमजोर वस्तु की इमेजिंग चरण में रैखिक होती है। हेलो आर्टिफैक्ट मौजूद है, जैसे कि डार्क फील्ड माइक्रोस्कोपी में। कमजोर आयाम की जानकारी को डार्क फील्ड माइक्रोस्कोपी के रूप में चित्रित किया गया है।

    चित्र 2 । ज़र्निके चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का योजनाबद्ध आरेख।

    कमजोर चरण वस्तु eqn [12] के लिए, तब हमारे पास है

    सकारात्मक या नकारात्मक चरण विपरीत के लिए, क्रमशः, जहां जी चरण वलय का आयाम संप्रेषण है। कुंडलाकार कंडेनसर एपर्चर के परिणामस्वरूप कमजोर ऑब्जेक्ट ट्रांसफर फ़ंक्शन की प्रतिक्रिया में सुधार होता है।


    जैविक अनुसंधान में फेज-कंट्रास्ट और डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोपी का कितना उपयोग किया जाता है? - जीव विज्ञान

    फेज कंट्रास्ट और डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी पूरक तकनीकें हैं जो पारदर्शी जैविक चरणों की उच्च विपरीत छवियों का उत्पादन करने में सक्षम हैं जो आमतौर पर नमूने के माध्यम से गुजरने वाली दृश्य प्रकाश तरंगों के आयाम को प्रभावित नहीं करती हैं। चूंकि चरण अंतर मानव आंखों के लिए ज्ञानी नहीं हैं, और ब्राइटफील्ड रोशनी के तहत माइक्रोस्कोप में आसानी से नहीं देखे जाते हैं, इसलिए चरण नमूनों की संतोषजनक छवियों का उत्पादन करने के लिए माइक्रोस्कोप के माध्यम से प्रकाश पथ को उपयुक्त रूप से संशोधित किया जाना चाहिए। कई लोकप्रिय विपरीत-बढ़ाने वाली तकनीकें जैविक सामग्री को पार करने वाली तरंगों और आसपास के माध्यम से गुजरने वाली तरंगों के बीच ऑप्टिकल पथ अंतर को संशोधित करने के लिए चरण नमूनों की क्षमता पर निर्भर करती हैं।

    शायद अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट और चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के बीच सबसे मौलिक अंतर ऑप्टिकल आधार है जिस पर पूरक तकनीकों द्वारा छवियां बनाई जाती हैं। चरण कंट्रास्ट छवि तीव्रता मूल्यों को नमूना ऑप्टिकल पथ लंबाई परिमाण के एक समारोह के रूप में उत्पन्न करता है, जिसमें बहुत घने क्षेत्र (जिनके पथ की लंबाई बड़ी होती है) पृष्ठभूमि की तुलना में गहरे दिखाई देते हैं। वैकल्पिक रूप से, नमूना विशेषताएं जिनमें अपेक्षाकृत कम मोटाई होती है, या आसपास के माध्यम से कम अपवर्तक सूचकांक, मध्यम ग्रे पृष्ठभूमि पर आरोपित होने पर बहुत हल्का प्रदान किया जाता है।

    डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट के लिए स्थिति काफी अलग है, जहां ऑप्टिकल पाथ लेंथ ग्रेडिएंट्स (वास्तव में, वेवफ्रंट शीयर की दिशा में परिवर्तन की दर) मुख्य रूप से नमूना छवियों में कंट्रास्ट को पेश करने के लिए जिम्मेदार हैं। पथ की लंबाई में खड़ी ढाल उत्कृष्ट विपरीत उत्पन्न करती है, और छवियां एक छद्म त्रि-आयामी राहत छायांकन प्रदर्शित करती हैं जो डीआईसी तकनीक की विशेषता है। बहुत उथले ऑप्टिकल पथ ढलान वाले क्षेत्र, जैसे कि विस्तारित, सपाट नमूनों में देखे गए, महत्वहीन विपरीतता उत्पन्न करते हैं और अक्सर पृष्ठभूमि के समान तीव्रता स्तर पर छवि में दिखाई देते हैं।

    कंट्रास्ट-गठन तंत्र में अंतर के अलावा, डीआईसी और चरण विपरीत छवियां कई अन्य विशेषताओं में भिन्न होती हैं। चित्र 1 में सचित्र कई डिजिटल छवियां हैं जो डीआईसी और चरण कंट्रास्ट में कैप्चर किए गए नमूनों की तुलना करती हैं। एक मानव मुख म्यूकोसा उपकला (गाल) कोशिका, ऊपरी सतह पर नाभिक, साइटोप्लाज्मिक समावेशन और कई बैक्टीरिया को प्रकट करती है, चित्र 1 (ए) में प्रस्तुत की जाती है, जिसे अंतर हस्तक्षेप विपरीत के साथ चित्रित किया गया है। चरण कंट्रास्ट रोशनी के साथ एक ही दृश्यक्षेत्र चित्र 1(बी)में दिखाया गया है। चरण विपरीत छवि में सेलुलर परिधि और नाभिक के चारों ओर स्पष्ट हेलो हैं, जो अंतर हस्तक्षेप विपरीत छवि में अनुपस्थित हैं। ऑप्टिकल सेक्शनिंग डीआईसी माइक्रोस्कोपी जांच (सचित्र नहीं) से पता चलता है कि बैक्टीरिया मौजूद हैं (लगभग विशेष रूप से) झिल्ली की सतह पर जो सेल के नीचे झूठ बोलने के विपरीत आसपास के मीडिया में नहाया जाता है। इस तथ्य को चरण विपरीत के साथ स्पष्ट रूप से निर्धारित नहीं किया जा सकता है।

    चित्रा 1 (सी) में, डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट के साथ चित्रित मुराइन किडनी ऊतक का एक मोटा खंड एक ट्यूबल के भीतर संलग्न कोशिकाओं के एक बंडल को प्रकट करता है। एक ही क्षेत्र की एक चरण विपरीत छवि (चित्र 1 (डी)) फोकस के विमान के बाहर चरण हेलो की उपस्थिति से भ्रमित और परेशान है। हालांकि, कई सेलुलर नाभिक चरण विपरीत छवि में दिखाई देते हैं, जो डीआईसी में अलग नहीं हैं। डीआईसी और चरण कंट्रास्ट में एक ओबेलिया पॉलीपॉइड एन्युलेटेड स्टेम पेरिसार्क के अपेक्षाकृत उच्च आवर्धन दृश्य क्रमशः आंकड़े 1 (ई) और 1 (एफ) में चित्रित किए गए हैं। डीआईसी में, (चित्रा 1 (ई)) कुंडलाकार संरचना आंतरिक किरणों के साथ अर्धगोलाकार दिखाई देती है जो तने से रेडियल रूप से निकलती है। इसके अलावा, स्टेम संरचना के भीतर दानेदार कण दिखाई दे रहे हैं, लेकिन संरचनात्मक विवरण काफी हद तक अपरिभाषित है। चरण विपरीत छवि (चित्र 1(f)) कुंडलाकार वलय के चारों ओर और तने के भीतर हलो द्वारा भ्रमित होती है।

    फेज कंट्रास्ट पर डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट का एक प्राथमिक लाभ फेज प्लेट्स या कंडेनसर एन्युली के मास्किंग प्रभाव के बिना पूर्ण संख्यात्मक एपर्चर पर उपकरण का उपयोग करने की क्षमता है, जो कंडेनसर और उद्देश्य एपर्चर के आकार को गंभीर रूप से प्रतिबंधित करता है। प्रमुख लाभ अक्षीय रिज़ॉल्यूशन में सुधार है, विशेष रूप से बड़े एपर्चर आकारों में उत्कृष्ट उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों का उत्पादन करने के लिए डीआईसी माइक्रोस्कोप की क्षमता के संबंध में। चित्र 2 में सचित्र डिजिटल छवियां हैं जो डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट (चित्रा 2 (ए)) और चरण कंट्रास्ट (चित्रा 2 (बी)) माइक्रोस्कोप में उद्देश्य रियर एपर्चर के बर्ट्रेंड लेंस के साथ हासिल की गई हैं। दोनों ही मामलों में, उद्देश्य 0.75 के संख्यात्मक एपर्चर वाले 40x फ्लोराइट है, और कंडेनसर एपर्चर डायाफ्राम सबसे बड़े व्यास के आकार के लिए खोला जाता है। यहां तक ​​​​कि जगह में पोलराइज़र और कंडेनसर में स्थापित नोमार्स्की प्रिज्म के साथ, डीआईसी एपर्चर चरण कंट्रास्ट एपर्चर से काफी बड़ा है, मुख्यतः क्योंकि चरण कंडेनसर एनलस रोशनी के एक महत्वपूर्ण हिस्से को प्रतिबंधित करता है जो आमतौर पर माइक्रोस्कोप ऑप्टिकल ट्रेन को पार करेगा।

    चरण कंट्रास्ट में अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट में निहित स्पष्ट अज़ीमुथल प्रभाव का अभाव है, जो माइक्रोस्कोप ऑप्टिकल अक्ष और पोलराइज़र के संबंध में बीमस्प्लिटिंग नोमार्स्की (या संशोधित वोलास्टन) प्रिज्म के विषम अभिविन्यास द्वारा प्रकट होता है। अभिविन्यास प्रभाव की अनुपस्थिति इसलिए होती है क्योंकि एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप कंडेनसर (चित्रा 2 (बी)) में कुंडलाकार चरण प्लेट 360 डिग्री के माध्यम से घूर्णी रूप से सममित होती है और सभी कोणों से समान रूप से नमूने को रोशन करती है। नतीजतन, चरण विपरीत छवि अभिविन्यास से स्वतंत्र है और घूर्णी-निर्भर विपरीत प्रभावों के अधीन नहीं है। डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट में इमेज किए गए कई नमूनों के लिए, अधिकतम कंट्रास्ट (कतर अक्ष के समानांतर या लंबवत) प्राप्त करने के लिए एक पूर्वापेक्षा अभिविन्यास नमूना रोटेशन की स्वतंत्रता को प्रतिबंधित करता है, विशेष रूप से रैखिक या निकट-अंतराल आवधिक संरचनाओं के लिए।

    डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट में अज़ीमुथ कंट्रास्ट इफेक्ट का उपयोग माइक्रोस्कोप को 360-डिग्री रोटेटिंग सर्कुलर सैंपल स्टेज से लैस करके लाभ के लिए किया जा सकता है। मूल रूप से ध्रुवीकृत प्रकाश माइक्रोस्कोपी में टिप्पणियों के लिए डिज़ाइन किया गया, परिपत्र चरण ऑपरेटर को चयनित नमूना सुविधाओं के लिए विपरीत प्रभावों को अधिकतम या कम करने के लिए प्रिज्म कतरनी अक्ष के संबंध में नमूने को घुमाने में सक्षम बनाता है। डीआईसी माइक्रोस्कोपी में कंट्रास्ट रैखिक चरण नमूनों के लिए एक न्यूनतम स्तर प्राप्त करता है जो कतरनी की दिशा में विस्तारित होता है, लेकिन कुछ डिग्री से चरण को घुमाकर महत्वपूर्ण रूप से भिन्न हो सकता है। गैर-रैखिक नमूने, जैसे कि कोशिकाएं, ऊतक अनुभाग, कण, और अनाकार पॉलिमर, डीआईसी में एक महत्वपूर्ण दिगंश प्रभाव प्रदर्शित नहीं करते हैं, और आमतौर पर विभिन्न प्रकार के झुकावों में संतोषजनक ढंग से चित्रित किए जा सकते हैं।

    चित्र 3 में प्रस्तुत दो रैखिक नमूने हैं जिनमें महत्वपूर्ण मात्रा में आवधिकता और विषमता है जो चरण विपरीत और डीआईसी दोनों में अंकित है। दोनों ही मामलों में, डीआईसी से प्राप्त छवियों में विपरीत माइक्रोस्कोप के कतरनी अक्ष के संबंध में नमूने के उन्मुखीकरण पर काफी हद तक निर्भर है, जबकि चरण विपरीत छवि विशेषताएं माइक्रोस्कोप ऑप्टिकल अक्ष के चारों ओर नमूना रोटेशन से स्वतंत्र हैं। आंकड़े 3 (ए) और 3 (बी) में छवियां डीआईसी में द्विपक्षीय रूप से सममित लम्बी पेनेट डायटम फ्रस्ट्यूल के घुड़सवार नमूने से प्राप्त की गई थीं। जब डायटम की लंबी धुरी नोमार्स्की प्रिज्म शीयर अक्ष के समानांतर संरेखित होती है (चित्र 3(ए)) छिन्नक में लकीरें और छिद्र आसानी से देखे जाते हैं। चित्रा 3 (ए) के ऊपरी दाएं कोने में सफेद तीर चित्रा 3 में दिखाए गए डीआईसी छवियों के लिए नोमार्स्की प्रिज्म कतरनी अक्ष को दर्शाता है। डायटम को 90 डिग्री (कतरनी अक्ष के लंबवत) से घुमाने से कुंठित छवि में विपरीतता कम हो जाती है। और सूक्ष्म संरचना में मौजूद महत्वपूर्ण विवरणों को अस्पष्ट करता है। उदाहरण के लिए, चित्र 3(ए) में किनारों और छिन्नक के केंद्र पर आसानी से देखी जाने वाली अनुदैर्ध्य लकीरें चित्र 3(बी) में अनुपस्थित हैं। अज़ीमुथ प्रभाव एक ही नमूने में अनुपस्थित होते हैं जब एक चरण विपरीत ऑप्टिकल सिस्टम (चित्रा 3 (सी)) का उपयोग करके इमेज किया जाता है, जो नमूना अभिविन्यास की परवाह किए बिना समान विपरीत प्रदर्शित करता है। ध्यान दें कि चित्र 3(c) में छवि कंट्रास्ट अधिक दृढ़ता से मिलता-जुलता है जो चित्र 3(a) में प्रस्तुत उच्च कंट्रास्ट छवि के बजाय चित्र 3(b) में DIC छवि द्वारा प्रदर्शित होता है। इस मामले में, अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट में नमूना अभिविन्यास के परिणामस्वरूप अज़ीमुथल प्रभावों के लाभ स्पष्ट रूप से स्पष्ट हैं।

    अज़ीमुथ प्रभावों का एक दूसरा उदाहरण जो डीआईसी में मौजूद है, लेकिन चरण विपरीतता में कमी है, चित्र 3 (डी) से 3 (एफ) में चित्रित किया गया है। नमूना एक अर्ध-पारदर्शी ctenoid मछली का पैमाना है जिसमें हीरे के आकार का समावेश होता है जिसमें गंभीर रूप से विपरीतता की कमी होती है और जब पैमाने के धारीदार शरीर की रीढ़ पर आरोपित किया जाता है तो अंतर करना मुश्किल होता है। जब केटेनॉइड स्केल डीआईसी माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 (डी)) में कतरनी अक्ष के समानांतर शरीर की रीढ़ की हड्डी के साथ उन्मुख होता है, तो पारदर्शी आयताकार समावेशन दिखाई देते हैं और शरीर की रीढ़ को मुखौटा करते हैं। माइक्रोस्कोप चरण को 90 डिग्री तक घुमाने से समावेशन का कंट्रास्ट स्तर कम हो जाता है, और धारीदार रीढ़ स्पष्ट रूप से दिखाई देने लगती हैं (चित्र 3(ई))। चरण विपरीत (चित्रा 3 (एफ)) में, समावेशन के साथ मौजूद हैलोस, साथ ही धारीदार रीढ़, नमूना अभिविन्यास के बावजूद मौजूद हैं।

    विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट में छवि विपरीत और नमूना अभिविन्यास के बीच संबंध का उपयोग अक्सर विस्तारित रैखिक नमूनों की जांच में लाभ के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, डायटम फ्रस्ट्यूल और इसी तरह के नमूनों में उच्च क्रम वाली संरचनाएं ओवरलैप हो सकती हैं, जिससे चरण विपरीत और समान विपरीत-बढ़ाने वाली तकनीकों में देखे जाने पर भ्रमित करने वाली छवियां होती हैं। कई झुकावों पर छवियों को कैप्चर करके, डीआईसी माइक्रोस्कोपी अक्सर कई विस्तारित, रैखिक नमूनों में मौजूद जटिल आकारिकी की अधिक स्पष्ट समझ प्रस्तुत करने में सक्षम होता है। इसके अलावा, जब ऑप्टिकल सेक्शनिंग पद्धति को अज़ीमुथ-विशिष्ट इमेजिंग के साथ जोड़ा जाता है, तो अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी अक्सर उन विशेषताओं को प्रकट कर सकता है जो वैकल्पिक तकनीकों का उपयोग करके भेद करना मुश्किल या असंभव है।

    हेलो और शेड-ऑफ आर्टिफैक्ट्स

    चरण कंट्रास्ट ऑप्टिकल सिस्टम को प्रभावित करने वाले प्रभामंडल और छाया-बंद कलाकृतियां अंतर हस्तक्षेप विपरीत छवियों में काफी हद तक अनुपस्थित हैं। सकारात्मक चरण विपरीत में, आसपास के माध्यम की तुलना में एक उच्च अपवर्तक सूचकांक के साथ नमूना सुविधाओं को एक उज्ज्वल फ्रिंज (प्रभामंडल) के साथ घेर लिया जाता है जो अक्सर किनारे के विवरण को अस्पष्ट करता है। यद्यपि उद्देश्य चरण प्लेट डिजाइन में विन्यास संशोधनों द्वारा हेलो को सीमित डिग्री तक दबाया जा सकता है, लेकिन उन्हें पूरी तरह से समाप्त नहीं किया जा सकता है। कुछ मामलों में, विभेदक हस्तक्षेप विपरीत छवियां किनारों के साथ अत्यधिक चमक से ग्रस्त होती हैं, जिनमें बहुत तेज ऑप्टिकल ग्रेडिएंट होते हैं, लेकिन यह प्रभाव आमतौर पर तब होता है जब पूर्वाग्रह मंदता मान बहुत कम होते हैं, और नोमार्स्की प्रिज्म (या डी S narmont) के उचित समायोजन द्वारा इसे दरकिनार किया जा सकता है। कम्पेसाटर पोलराइज़र) स्थिति।

    चरण विपरीत में हेलो की उपस्थिति और गंभीरता, आंशिक रूप से, नमूना और आसपास के माध्यम के बीच अपवर्तक सूचकांक अंतर पर निर्भर है। अक्सर, चरण विपरीत नमूनों में विभिन्न प्रकार की संरचनाएं होती हैं जो बेतहाशा उतार-चढ़ाव वाले अपवर्तक सूचकांकों को प्रदर्शित करती हैं, जो एक साथ जटिल छवियां उत्पन्न करती हैं। आसपास के माध्यम की तुलना में कम अपवर्तनांक वाले क्षेत्रों में उच्च अपवर्तक सूचकांक सुविधाओं के आसपास देखे जा सकने वाले उज्ज्वल हेलो के विपरीत अंधेरे हेलो प्रदर्शित होते हैं। चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप ऑप्टिकल सिस्टम के विन्यास मापदंडों के कारण हेलो उत्पन्न होते हैं। नमूना द्वारा विचलित आपतित प्रकाश का एक छोटा भाग विवर्तित तरंगाग्रों की गोलाकार प्रकृति के कारण वस्तुनिष्ठ चरण प्लेट से होकर गुजरता है। छोटी नमूना विशेषताएं बड़े विवर्तन कोणों को जन्म देती हैं, लेकिन बड़ी विस्तारित संरचनाएं विवर्तित तरंगफ्रंट उत्पन्न कर सकती हैं जिनमें उथले कोण होते हैं जो अक्सर चरण प्लेटों द्वारा कब्जा किए गए उद्देश्य एपर्चर क्षेत्र के भीतर आते हैं।

    प्रभामंडल कलाकृतियों के संबंध में चरण कंट्रास्ट और डीआईसी छवियों के बीच तुलना चित्र 4 में तीन सामान्य रूप से चित्रित पारदर्शी नमूनों के लिए प्रस्तुत की गई है। मानव एरिथ्रोसाइट्स (लाल रक्त कोशिकाएं) डिस्क के आकार की कोशिकाओं के आसपास एक विशिष्ट प्रभामंडल प्रदर्शित करती हैं, जब मध्यम और उच्च आवर्धन (चित्रा 4 (ए)) पर सकारात्मक चरण विपरीत में चित्रित किया जाता है। ध्यान दें कि इस क्षेत्र में ऑप्टिकल पथ की लंबाई कम होने के कारण एरिथ्रोसाइट डिस्क का मध्य भाग परिधि से हल्का है। जब एक ही व्यूफील्ड की जांच डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट (चित्रा 4 (बी)) में की जाती है, तो कोशिकाओं के आसपास की प्रभामंडल कलाकृतियां अनुपस्थित होती हैं, लेकिन छवियां नोमार्स्की प्रिज्म शीयर अक्ष (उत्तर-पश्चिम से दक्षिण-पूर्व) के साथ उन्मुख एक छाया-कास्ट उपस्थिति प्राप्त करती हैं, जो है कोशिकाओं के विपरीत दिशा (निचले दाएं) पर संबंधित लकीरों की तुलना में बाहरी लकीरों के ऊपरी बाएं हिस्से में दिखने में बहुत हल्का होता है।

    मोनोलेयर संस्कृति में विकसित जीवित कोशिकाओं को अक्सर चरण विपरीत और अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी दोनों का उपयोग करके देखा और चित्रित किया जाता है। ग्लास कवरस्लिप पर संस्कृति में कई अनुयाई हेला कोशिकाओं को चरण विपरीत प्रकाशिकी के साथ चित्र 4 (सी) में चित्रित किया गया है। हेलो कलाकृतियां कोशिका झिल्ली की परिधि को घेर लेती हैं और कोशिकाओं के भीतर कुछ बड़े जीवों पर भी स्पष्ट होती हैं। यद्यपि इस छवि में कई आंतरिक सेलुलर विवरण उच्च रिज़ॉल्यूशन पर मौजूद हैं, इंट्रासेल्युलर अनुबंधों के बारे में जानकारी आसन्न सेल झिल्ली के बीच दिखाई देने वाले उज्ज्वल (प्रभामंडल) क्षेत्रों द्वारा दबा दी जाती है। प्रभामंडल कलाकृतियों की अनुपस्थिति समान दृश्यक्षेत्र (चित्र 4(d)) में स्पष्ट होती है जब विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट के साथ प्रतिबिम्बित किया जाता है। कोशिकाओं के आंतरिक विवरण डीआईसी में कम स्पष्ट होते हैं, लेकिन सेलुलर झिल्ली की परिधि को चरण विपरीत की तुलना में अधिक स्पष्ट रूप से चित्रित किया जाता है। वास्तव में, डीआईसी छवि में पड़ोसी कोशिकाओं की निकटता बहुत स्पष्ट है, जो संपर्क अवरोध जैसे अंतरकोशिकीय घटनाओं के अध्ययन के लिए तकनीक को अधिक सटीक बनाती है।

    फिलामेंटस हरी शैवाल जीनस, ज़िग्नेमा के सदस्य, व्यक्तिगत सेलुलर इकाइयों को दोहराने से बना एक लंबी, रैखिक संरचना प्रदर्शित करते हैं। चरण विपरीत (चित्रा 4 (ई)) में, फिलामेंटस ज़िग्नेमा नमूने रॉड की तरह शैवाल फिलामेंट्स के बाहरी हिस्से के आसपास एक स्पष्ट प्रभामंडल प्रदर्शित करते हैं, लेकिन इसमें पर्याप्त आंतरिक विवरण भी होता है जो हेलो आर्टिफैक्ट द्वारा अस्पष्ट होता है। द्वि-सममितीय U-आकार की दोहराई जाने वाली आंतरिक कोशिकीय संरचनाएं (चित्र 4(e)) बड़े आभामंडल को जन्म देती हैं जो कि विपरीतता को काफी कम कर देती हैं और छोटी विशेषताओं को मुखौटा बना देती हैं। डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट Zygnema (चित्र 4 (f)) की चरण विपरीत छवियों में मौजूद प्रभामंडल कलाकृतियों को समाप्त करता है, और फिलामेंट के केंद्र में मौजूद आंतरिक विवरण का काफी अधिक खुलासा करता है। हालांकि, Zygnema फिलामेंट संरचना के बारे में सबसे निश्चित निष्कर्ष प्राप्त करने के लिए, दो इमेजिंग तकनीकों को संयोजन के रूप में लागू किया जाना चाहिए (जैसा कि ऊपर वर्णित कई नमूनों के मामले में है)।

    जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, नमूना सुविधाओं में आसपास के माध्यम की तुलना में एक उच्च अपवर्तक सूचकांक होता है जो परिधि के चारों ओर उज्ज्वल हेलो प्रदर्शित करता है और सकारात्मक चरण विपरीत ऑप्टिकल सिस्टम के साथ चित्रित होने पर गहरे केंद्रीय भाग प्रदर्शित करता है। विपरीत प्रभाव तब होता है जब माध्यम से कम अपवर्तनांक वाले लक्षण देखे जाते हैं (अंधेरे हलो और हल्के आंतरिक क्षेत्र)। हेलो प्रभाव नमूना विशेषता के आकार के साथ भिन्न होते हैं और नमूना और आसपास के माध्यम के बीच अपवर्तक सूचकांक अंतर पर बहुत अधिक निर्भर होते हैं। अपवर्तक सूचकांक में बड़े अंतर अधिक स्पष्ट प्रभामंडल प्रभाव उत्पन्न करते हैं, जो कि चरण प्लेट आयाम और तटस्थ घनत्व, और उद्देश्य आवर्धन कारक जैसे वाद्य मापदंडों पर भी निर्भर होते हैं। इसके अलावा, नमूना सुविधा आकार चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी में प्रभामंडल कलाकृतियों की गंभीरता को निर्धारित करने में एक सर्वोपरि भूमिका निभाता है।

    डीआईसी माइक्रोस्कोपी में स्थिति काफी अलग है, जहां बड़े अपवर्तक सूचकांक अंतर और नमूना फीचर आकार छवि गुणवत्ता को खराब नहीं करते हैं।वास्तव में, नमूना और उसके आसपास के माध्यम के बीच अपवर्तक सूचकांक के स्पष्ट अंतर अक्सर अत्यधिक वांछनीय होते हैं, और आमतौर पर अंतर हस्तक्षेप विपरीत में उत्कृष्ट छवियों की ओर ले जाते हैं। फ़ीचर आकार आमतौर पर डीआईसी माइक्रोस्कोपी में कोई समस्या नहीं पेश करता है। आकार और अपवर्तक सूचकांक में बड़े उतार-चढ़ाव वाले नमूनों को उत्कृष्ट कंट्रास्ट वाली संरचनाओं को उत्पन्न करने के लिए अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट ऑप्टिकल सिस्टम के साथ एक साथ (साइड-बाय-साइड) अक्सर इमेज किया जा सकता है, जो कि मिनट के विवरण को भी देखा और पहचाना जा सकता है।

    हेलो कलाकृतियों और छवि कंट्रास्ट भी नमूने की ऑप्टिकल मोटाई से डीआईसी माइक्रोस्कोपी की तुलना में चरण विपरीत में बहुत बड़ी डिग्री से प्रभावित होते हैं। बड़े ऑप्टिकल पथ अंतर (आधे तरंग दैर्ध्य तक) पर, अस्पष्ट चरण विपरीत छवियों का उत्पादन किया जा सकता है क्योंकि एक नमूने में सबसे मोटी विशेषताएं अक्सर विपरीत स्तर प्रदर्शित करती हैं जो सबसे पतली विशेषताओं के बहुत करीब या समान होती हैं। यह ऑप्टिकल पथ लंबाई (नमूना मोटाई और अपवर्तक सूचकांक), कंट्रास्ट, और चरण कोणों के बीच जटिल संबंधों से उत्पन्न होता है। सामान्य तौर पर, आदर्श चरण विपरीत नमूनों में ऑप्टिकल पथ अंतर में लगभग दसवें तरंग दैर्ध्य से अधिक की विशेषताएं नहीं होनी चाहिए। डीआईसी माइक्रोस्कोपी के लिए पतले नमूने भी वांछनीय हैं, लेकिन तकनीक उन नमूनों के साथ उपयुक्त छवियों का निर्माण करने में सक्षम है जिनमें चरण विपरीत के लिए अनुशंसित की तुलना में बहुत अधिक मोटाई मान (और ऑप्टिकल पथ लंबाई) हैं। हालांकि, बहुत मोटे नमूने उद्देश्य और कंडेनसर प्रिज्म के बीच हस्तक्षेप विमानों के ओवरलैप को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं, जिससे डीआईसी छवियों में गुणवत्ता और विपरीतता कम हो जाती है।

    समान ऑप्टिकल पथ लंबाई के फ्लैट, विस्तारित नमूनों में, छाया-बंद के रूप में जाना जाने वाला एक आर्टिफैक्ट आमतौर पर चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी में देखा जाता है। छाया-बंद नमूने के मध्य भाग द्वारा प्रकट होता है, जो इसके विपरीत धीरे-धीरे कमी प्रदर्शित करता है जब तक कि तीव्रता आसपास के माध्यम तक नहीं पहुंच जाती। चरम मामलों में, विस्तारित नमूने केवल उनके प्रभामंडल की उपस्थिति के कारण चरण विपरीत में दिखाई देंगे। डीआईसी में, छवि तीव्रता में भिन्नता केवल तभी होती है जब ऑप्टिकल पथ अंतर में एक उल्लेखनीय परिवर्तन होता है, और विस्तारित नमूनों की सीमाएं अक्सर एकमात्र विशेषता होती हैं जिसे इस तकनीक से पहचाना जा सकता है।

    क्षेत्र की गहराई और ऑप्टिकल सेक्शनिंग

    चूंकि चरण विपरीत छवियां अस्पष्ट हो सकती हैं (या यहां तक ​​कि इसके विपरीत का अनुभव भी हो सकता है) जब नमूना ऑप्टिकल पथ की लंबाई एक बड़ी सीमा पर उतार-चढ़ाव होती है, तो तकनीक को एक-दसवें तरंग दैर्ध्य या उससे कम के पथ अंतर वाले नमूनों तक ही सीमित रखा जाना चाहिए, जैसा कि पहले चर्चा की गई थी . दूसरे शब्दों में, मोटे नमूने, या पच्चर के आकार की संरचना वाले, आमतौर पर चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के साथ मात्रात्मक जांच के लिए उपयुक्त नहीं होते हैं। पतले नमूने भी अंतर हस्तक्षेप विपरीत में बेहतर छवियों का उत्पादन करते हैं, लेकिन मोटे नमूने (एक-दसवें और पूर्ण तरंग दैर्ध्य के बीच एक ऑप्टिकल पथ अंतर वाले) को ऑप्टिकल सेक्शनिंग तकनीकों का उपयोग करके व्यापक एपर्चर पर भी चित्रित किया जा सकता है।

    चरण विपरीत में रोशनी एपर्चर कंडेनसर एनलस के आकार से तय होता है और क्षेत्र की बढ़ी हुई या घटी हुई गहराई को प्राप्त करने के लिए इसे अलग नहीं किया जा सकता है। यह प्रतिबंध महत्वपूर्ण प्रभामंडल कलाकृतियों वाले नमूनों की टिप्पणियों को बाधित करता है, जो कभी-कभी उद्देश्य फोकल विमान के बाहर उत्पन्न होने वाले अत्यधिक प्रकाश से उत्पन्न अतिव्यापी विवरण के कारण केंद्रित नमूना सुविधाओं को अस्पष्ट कर सकते हैं। ऐसी समस्याएं अक्सर तब उत्पन्न होती हैं जब छवि नमूनों का प्रयास किया जाता है जो चरण विपरीत के लिए बहुत मोटे होते हैं। हालांकि, जैसा कि पहले चर्चा की गई थी, अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी (विस्तृत कंडेनसर एपर्चर आकारों पर) की ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता अपेक्षाकृत मोटे नमूनों के साथ उत्कृष्ट छवियों को प्राप्त करने में सक्षम बनाती है।

    डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट में मोटे नमूनों से बड़े एपर्चर ऑप्टिकल सेक्शन के लाभों को चित्र 5 में दिखाया गया है, और चरण कंट्रास्ट के साथ इमेज किए गए समान व्यूफील्ड की तुलना में। चित्रा 5 (बी) ओबेलिया हाइड्रोज़ोन के प्रजनन पॉलीप से एक मेडुसा कली को दिखाता है जो डीआईसी में उच्च आवर्धन पर कंडेनसर आईरिस डायाफ्राम खोलने के साथ उद्देश्य एपर्चर आकार के लगभग 95 प्रतिशत पर सेट होता है। परिणामी पतले ऑप्टिकल खंड मेडुसा सुविधाओं के तेजी से केंद्रित छवि विवरण प्रकट करते हैं, जो केवल फोकल विमान से दूर होने वाले प्रकाश द्वारा कम से कम अस्पष्ट होते हैं। जब एक ही व्यूफील्ड की फेज कंट्रास्ट (चित्र 5(ए)) में जांच की जाती है, तो मेडुसा छवि हेलो द्वारा धुंधली हो जाती है और ऑप्टिकल सिस्टम के प्रतिबंधित एपर्चर के कारण कम रिज़ॉल्यूशन प्रदर्शित करती है।

    इसी तरह की स्थितियों को चित्र 5(c) से 5(f) तक में प्रस्तुत किया गया है। चित्रा 5 (सी) उत्तरी अमेरिका में सबसे आम तितलियों में से एक, मोनार्क तितली (डैनॉस प्लेक्सिपस) से ओवरलैपिंग विंग स्केल को दर्शाता है। प्रभामंडल कलाकृतियों और अस्पष्ट विशेषताओं के कारण चित्र 5(c) में अलग-अलग तराजू अलग-अलग नहीं हैं जो फ़ोकस के विमान में नहीं हैं। सामान्य तौर पर, छवि कई कलाकृतियों से भ्रमित होती है, जिससे नमूना सुविधाओं को समझना मुश्किल हो जाता है। डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट (चित्रा 5 (डी)) में एक ही नमूने का इमेजिंग फोकल प्लेन से दूर स्थित कई विचलित करने वाली कलाकृतियों को समाप्त करता है और एक सिंगल विंग स्केल में सतह की विशेषताओं को स्पष्ट रूप से चित्रित करता है। इसी तरह, एक कैनाइन ककड़ी टैपवार्म (डिपिलिडियम कैनिनम) के पेट के भीतर एक अंडे का पैकेट डीआईसी (चित्रा 5 (एफ)) में चित्रित होने पर व्यक्तिगत अंडों के आसपास के तेज किनारों को प्रकट करता है। हालांकि, केंद्रित अंडे चरण विपरीत (चित्रा 5 (ई)) में विशिष्ट संरचना से रहित होते हैं, मुख्य रूप से फोकल विमान से दूर स्थित अन्य अंडों के हेलो के कारण।

    बड़े कंडेनसर एपर्चर आकार और उच्च संख्यात्मक एपर्चर में अंतर हस्तक्षेप विपरीत की ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता मोटे चरण नमूनों में एकल फोकल विमानों की इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है। तत्काल फोकल प्लेन के बाहर पड़ी सुविधाओं से विवरण और भटका हुआ प्रकाश डीआईसी छवियों को उसी तरह से समझौता नहीं करता है जैसे चरण विपरीत छवियों, जो अक्सर हेलो कलाकृतियों द्वारा जटिल होते हैं। नतीजतन, कुछ प्रतिकूल परिस्थितियों (बहुत मोटे नमूने) के तहत उत्कृष्ट छवियों को प्राप्त करने के लिए अंतर हस्तक्षेप विपरीत को नियोजित किया जा सकता है, तब भी जब क्षेत्र की बड़ी गहराई अतिव्यापी विवरण के कारण चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी में चरण संरचनाओं की पहचान को असंभव बना देती है।

    डीआईसी की तुलना में फेज कंट्रास्ट का एक फायदा यह है कि डाइक्रोइक और द्विअर्थी नमूनों की सफलतापूर्वक छवि बनाने की क्षमता है। क्योंकि डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट ऑप्टिकल सिस्टम वेवफ्रंट फील्ड के उन्मुखीकरण को स्थापित करने के लिए ध्रुवीकृत प्रकाश पर निर्भर करते हैं, एक द्विअर्थी या डाइक्रोइक नमूने द्वारा साधारण और असाधारण तरंगों के अंतर अवशोषण से भ्रमित करने वाली छवियां होती हैं। चरण कंट्रास्ट को ध्रुवीकृत प्रकाश के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है, और यह द्विअर्थी नमूनों द्वारा उत्पन्न ऑप्टिकल गड़बड़ी से मुक्त है।

    डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी में बायरफ्रींग कलाकृतियों से संबंधित प्राथमिक चिंताओं में से एक प्लास्टिक टिशू कल्चर वाहिकाओं के व्यापक उपयोग से उत्पन्न होती है। ढाला बहुलक पोत संरचना में निहित तनाव अत्यधिक द्विभाजन उत्पन्न करता है जो प्रकाश को विध्रुवित करता है और डीआईसी छवियों की व्याख्या को भ्रमित करता है। इस प्रकार, इन कंटेनरों में उगाई गई जीवित कोशिकाओं को विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट के साथ संतोषजनक ढंग से चित्रित नहीं किया जा सकता है और इसके बजाय, आमतौर पर चरण कंट्रास्ट या हॉफमैन मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट ऑप्टिकल सिस्टम के साथ देखे और फोटो खिंचवाए जाते हैं।

    डीआईसी में द्विअर्थी नमूनों की इमेजिंग से उत्पन्न होने वाली विशिष्ट कलाकृतियों को चरण विपरीत में समान दृश्य क्षेत्रों की छवियों के साथ चित्र 6 में प्रस्तुत किया गया है। आलू (सोलनम ट्यूबरोसम) ऊतक के चौगुनी-दागदार पतले खंड से स्टार्च भंडारण कणिकाओं (ग्लोबुल्स के रूप में दिखाई देना), जो पेरिडर्म, कॉर्टेक्स और कम संवहनी ऊतकों के साथ परिपक्व कंद के एक हिस्से को भी दर्शाता है, आंकड़े 6 (ए) में प्रस्तुत किए गए हैं और 6 (बी)। चूंकि आलू स्टार्च अनाज में कार्बोहाइड्रेट एक क्रमबद्ध लैमेलर आणविक संरचना प्रदर्शित करते हैं, अनाज के हिस्से (और कुछ मामलों में, पूरे अनाज ही) द्विअर्थी होते हैं और ध्रुवीकृत तरंगों को अवशोषित करते हैं जो कंडेनसर नोमार्स्की प्रिज्म को छोड़ देते हैं और नमूने से गुजरते हैं। नतीजतन, डीआईसी माइक्रोस्कोपी में देखे गए आलू स्टार्च अनाज हस्तक्षेप रंग और विशेषता माल्टीज़ क्रॉस पैटर्न (क्रॉस पोलराइज़र से उत्पन्न) प्रदर्शित करते हैं, जो गोलाकार समरूपता (चित्रा 6 (बी)) वाले द्विभाजित अनिसोट्रोपिक नमूनों के विशिष्ट हैं। डीआईसी में बायरफ्रिंजेंस आर्टिफैक्ट स्टार्च अनाज की आंतरिक संरचना का अधिकांश हिस्सा मास्क करता है, जो कि चरण विपरीत (चित्रा 6 (ए)) में इमेज किए जाने पर कहीं अधिक विवरण प्रकट करता है, भले ही नमूना दाग दिया गया हो।

    चित्र 6 (सी) में चित्रित एक एकल रेयान फाइबर की एक चरण विपरीत छवि है जो कि सतह पर और बहुलक के अंदर मौजूद खड़ा आकारिकी दिखाती है। सोडियम हाइड्रॉक्साइड और कार्बन डाइसल्फ़ाइड के साथ थोक सामग्री का इलाज करके, और फिर स्पिनरनेट के माध्यम से परिणामी चिपचिपा समाधान पारित करके रेयान को सेल्युलोज, कपास लिंटर या लकड़ी के चिप्स से निर्मित किया जाता है। इस प्रक्रिया में उत्पादित तंतुओं में लंबी दूरी की व्यवस्था होती है और आमतौर पर बहुत अधिक द्विअर्थी होते हैं। रेयान फाइबर की डीआईसी परीक्षा (चित्रा 6(डी)) द्विअर्थी चरित्र की पुष्टि करती है, जो छवि में मौजूद न्यूटनियन हस्तक्षेप रंगों में प्रकट होता है। रंग, जबकि सुंदर, अस्पष्ट नमूना विस्तार और इस प्रकार की इमेजिंग सामग्री के लिए डीआईसी की उपयोगिता को कम करते हैं। चित्र 6(बी) और 6(डी) में चित्रित द्विअर्थी छवियों को कम आवर्धन (20x) पर अपेक्षाकृत पतले (5-20 माइक्रोमीटर) नमूनों का उपयोग करके रिकॉर्ड किया गया था जो पूरे दृश्य क्षेत्र में तेज फोकस में रहते हैं। जब मोटे द्विअर्थी नमूनों को डीआईसी के साथ चित्रित किया जाता है, तो फोकस के बिंदु से दूर विमानों से उत्पन्न होने वाले हस्तक्षेप रंग नमूना विवरण को बहुत अधिक डिग्री तक अस्पष्ट कर देते हैं। इसलिए, जैसे-जैसे नमूने की मोटाई बढ़ती है (द्विभाजित नमूनों के लिए), डीआईसी में उत्पन्न परिणामी छवियां इसके विपरीत खो देती हैं और गुणवत्ता तेजी से बिगड़ती है।

    डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्लास्टिक टिशू कल्चर वाहिकाओं में विकसित जीवित कोशिकाओं के अवलोकन से जुड़ी समस्याएं आंकड़े 6 (ई) और 6 (एफ) की तुलना करके स्पष्ट रूप से स्पष्ट हैं। मोनोलेयर संस्कृति में कई भारतीय मंटजैक (मुंटियाकस मंटजैक) हिरण त्वचा फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं को चित्र 6 (ई) में चित्रित किया गया है, जो एक उल्टे ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप पर चरण विपरीत में एक लंबी कार्य दूरी के उद्देश्य और कंडेनसर संयोजन का उपयोग करके चित्रित किया गया है। कोशिकाओं को लगभग 1.2 मिलीमीटर की ऊपरी और निचली दीवार की मोटाई वाले मोल्डेड पॉलीस्टाइनिन जहाजों में उगाया गया था (पॉलीस्टायरीन की संयुक्त मोटाई 2.4 मिलीमीटर है)। मोटे कांच या प्लास्टिक के माध्यम से अवलोकन के लिए डिज़ाइन किए गए सुधार कॉलर वाले चरण विपरीत उद्देश्यों के साथ भी, पतली (170 माइक्रोमीटर) कवर ग्लास प्लेटों पर इमेज किए गए कोशिकाओं की तुलना में छवि गुणवत्ता प्रभावित होती है (चित्र 6(ई) से चित्र 4(सी) की तुलना करें। ) हालांकि, अधिकांश आंतरिक सेलुलर विवरण अभी भी दिखाई दे रहे हैं, जिनमें नाभिक, न्यूक्लियोलस, रिक्तिकाएं और कई छोटे कण शामिल हैं।

    डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट में, चित्रा 6 (ई) में चित्रित सुसंस्कृत भारतीय मंटजैक फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाएं बायरफ्रींगेंट पॉलीस्टाइनिन कंटेनर से अवशोषण और हस्तक्षेप प्रभाव के कारण एक महत्वपूर्ण मात्रा में कंट्रास्ट (चित्रा 6 (एफ)) खो देती हैं। चूंकि कंटेनर की दीवारें अपेक्षाकृत मोटी होती हैं, इसलिए स्ट्रेन बायरफ्रींग टिशू कल्चर पोत की ऊपरी दीवार में सामान्य और असाधारण वेवफ्रंट्स को कोशिकाओं से गुजरने से पहले और एक बार फिर कोशिकाओं से बाहर निकलने और निचली दीवार से गुजरने के बाद विध्रुवित कर देता है। परिणाम इसके विपरीत इतनी गंभीर गिरावट है, कोशिकाओं को केवल तभी चित्रित किया जा सकता है जब कंडेनसर डायाफ्राम लगभग पूरी तरह से बंद हो जाता है (पारदर्शी नमूनों के साथ ब्राइटफील्ड तकनीकों के समान)। इन शर्तों के तहत, छवियां कम कंट्रास्ट के अलावा कई विवर्तन कलाकृतियों को प्रदर्शित करती हैं, और इस प्रकार के अवलोकन के लिए डीआईसी को व्यावहारिक रूप से बेकार कर देती हैं।

    जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, ध्रुवीकृत प्रकाश का उपयोग करने की आवश्यकता से अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी के साथ द्विअर्थी नमूनों की जांच करने में त्रुटियों का प्रमुख स्रोत उत्पन्न होता है। द्विअर्थी नमूनों में, ध्रुवीकृत ओर्थोगोनल (साधारण और असाधारण) तरंगाग्र नमूने के भीतर अनिसोट्रोपिक अणुओं के संबंध में उनके अभिविन्यास के आधार पर, विभिन्न डिग्री तक अवशोषित होते हैं। नतीजतन, जब ऑर्थोगोनल वेवफ्रंट्स को उद्देश्य नोमार्स्की प्रिज्म में पुनर्संयोजित किया जाता है और विश्लेषक के पास जाता है, तो वे विभिन्न तीव्रता के साथ हस्तक्षेप करते हैं। इसलिए, अंतिम छवि न केवल दो तरंगों (आमतौर पर डीआईसी में एक महत्वपूर्ण कारक) द्वारा अनुभव किए गए ऑप्टिकल पथ अंतर का एक कार्य है, बल्कि नमूने द्वारा प्रेरित दो बीमों के अंतर आयाम भी हैं। छवियों पर प्रभाव एक माइक्रोस्कोप विन्यास के समान होता है जिसमें ध्रुवीकरण और विश्लेषक के संचरण अक्ष पूरी तरह से लंबवत नहीं होते हैं (वास्तव में, थोड़ा अनियंत्रित)। क्योंकि चरण विपरीत ध्रुवीकृत प्रकाश पर निर्भर नहीं करता है, तकनीक काफी हद तक द्विअर्थी नमूनों द्वारा प्रेरित कलाकृतियों से मुक्त है।

    हल्के से सना हुआ आयाम नमूने, जो आवश्यक रूप से द्विअर्थी नहीं हैं, लेकिन चरण ढाल चरित्र की एक महत्वपूर्ण मात्रा को बनाए रख सकते हैं, चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी में उद्देश्य चरण प्लेट द्वारा दृश्य तरंग दैर्ध्य के अवशोषण के कारण कम तीव्रता का अनुभव करते हैं। हालांकि, ये नमूने अक्सर अंतर हस्तक्षेप विपरीत में संतोषजनक परिणाम उत्पन्न कर सकते हैं जब पर्याप्त ऑप्टिकल पथ ग्रेडियेंट मौजूद होते हैं और दोनों ध्रुवीकृत तरंगफ्रंट समान रूप से अवशोषित होते हैं। वास्तव में, इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल (उदाहरण के लिए, अक्षुण्ण नाभिक और मेटाफ़ेज़ क्रोमोसोम) के चयनात्मक धुंधलापन को डीआईसी माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग के लिए जोड़ा जा सकता है ताकि नमूना विस्तार को बढ़ाया जा सके और कोशिकाओं को तय किए जाने पर होने वाली घटनाओं को अलग किया जा सके।

    चित्रा 7 में सचित्र सामान्य जैविक (दृश्यमान प्रकाश अवशोषित) क्रोमोफोर के साथ दागे गए नमूनों के कई उदाहरण हैं, और दोनों चरण विपरीत और डीआईसी माइक्रोस्कोपी के साथ चित्रित हैं। मानव वसा से सना हुआ वसा ऊतक का एक पतला खंड अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट में देखा गया है जो चित्र 7 (ए) में प्रस्तुत किया गया है, और चित्रा 7 (बी) में चरण विपरीत के साथ एक ही दृश्य क्षेत्र है। चरण विपरीत छवि भ्रामक है और इसमें बारीक विवरण के समाधान का अभाव है, मुख्य रूप से प्रभामंडल कलाकृतियों के कारण जो जैविक दाग के लाभों को मुखौटा बनाते हैं। इस नमूने से कोई महत्वपूर्ण जानकारी प्राप्त करने के लिए चरण विपरीत स्पष्ट रूप से उपयुक्त नहीं है। भेद में, एक ही नमूने की एक संबंधित डीआईसी छवि (चित्रा 7 (ए)) छाया-कास्ट छद्म त्रि-आयामी राहत में वसा ग्लोब्यूल्स को प्रस्तुत करती है, जो उन्हें छवि में अन्य विशेषताओं से काफी अच्छी तरह से अलग करती है।

    चित्रा 7 (सी) में डीआईसी माइक्रोस्कोपी के साथ एक ही प्रभाव देखा जाता है, जहां एक मेंढक के वृषण के पतले खंड के भीतर विभेदित अर्धसूत्रीविभाजन नाभिक और गुणसूत्र उच्च विपरीत में देखे जा सकते हैं। यह छवि कई दागों के चतुर अनुप्रयोग से लाभान्वित होती है जो आनुवंशिक सामग्री को अन्य इंट्रासेल्युलर घटकों से रंगीन रूप से अलग करने में सहायता करती है। वास्तव में, डीआईसी में इमेज किए जाने पर नमूना अधिक महत्वपूर्ण जानकारी देता है, जो कि ब्राइटफील्ड रोशनी के लक्ष्य अवलोकन मोड में होता है। चरण विपरीत (चित्रा 7 (डी)) में एक ही दृश्य क्षेत्र घने दाग वाले इंट्रासेल्युलर घटकों के आस-पास के हेलो से भ्रमित होता है, जो इस इमेजिंग मोड में अंतर करना कहीं अधिक कठिन होता है। इसी तरह की स्थिति एक स्तनधारी दांत के दाग वाले पतले खंड के लिए मौजूद है जो चित्र 7 (ई) और 7 (एफ) में प्रस्तुत किया गया है। डीआईसी में, तामचीनी में धारीदार लैमेला उनकी राहत (चित्रा 7 (ई)) के कारण निरीक्षण करना आसान है, जबकि चरण विपरीत (चित्रा 7 (एफ)) में इन संरचनाओं को ओवरस्टेनिंग करने के लिए युग्मित इष्टतम ऑप्टिकल पथ अंतर से कम है। चित्र 7 में दिए गए उदाहरण इस बात का पुख्ता सबूत देते हैं कि विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट हल्के दाग वाले नमूनों को देखने के लिए एक उपयुक्त तकनीक है, भले ही समान नमूनों को चरण विपरीत में छवि के लिए मुश्किल हो।

    डीआईसी और चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के बीच सबसे स्पष्ट अंतर छद्म त्रि-आयामी छाया-कास्ट छवियां हैं जो अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट ऑप्टिकल सिस्टम द्वारा बनाई गई हैं। नमूना छवियों को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में कई वर्षों तक उपयोग की जाने वाली छायांकन तकनीकों की याद ताजा करने के तरीके में प्रस्तुत किया जाता है, जो नमूने के स्थलाकृतिक गुणों के बारे में जानकारी प्रदान करता है। हालांकि, डीआईसी में, छवियों में स्पष्ट पहाड़ियों और घाटियों को नमूने में वास्तविक स्थलाकृतिक प्रोफ़ाइल के संकेत के रूप में गलत नहीं माना जाना चाहिए, और हमेशा सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए। चरण कंट्रास्ट महत्वपूर्ण त्रि-आयामी चरित्र वाली छवियों का उत्पादन नहीं करता है।

    चरण कंट्रास्ट और डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के बीच कई समानताएं और अंतर तालिका 1 में छवि चमक, रिज़ॉल्यूशन, चरण शिफ्ट सीमाओं, कलाकृतियों, नमूना विशेषताओं और लागत सहित कई चर के लिए संक्षेपित हैं। संक्षेप में, चरण कंट्रास्ट और डीआईसी दोनों में छवि चमक सामान्य ब्राइटफील्ड अवलोकन की तुलना में बहुत कम (केवल कुछ प्रतिशत) है, लेकिन ये विपरीत-बढ़ाने वाली तकनीकें कहीं अधिक उच्च परिभाषित छवियां प्रदान करने में सक्षम हैं। चरण विपरीत की तुलना में डीआईसी माइक्रोस्कोपी के लिए रोशनी अधिक महत्वपूर्ण है, खासकर जब उच्च आवर्धन पर कम संचरण ध्रुवीकरण का उपयोग करते हैं। अक्सर, संतोषजनक इमेजिंग के लिए 100-वाट टंगस्टन-हैलोजन या पारा आर्क-डिस्चार्ज लैंप की आवश्यकता होती है, जबकि चरण विपरीत सूक्ष्मदर्शी 50-वाट तापदीप्त लैंप के साथ पर्याप्त रूप से प्रदर्शन करते हैं। डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी में लेटरल (एक्स-वाई) और एक्सियल (जेड) रेजोल्यूशन नाटकीय रूप से फेज कंट्रास्ट से अधिक है, जो दोनों आयामों में मामूली या खराब रिज़ॉल्यूशन प्रदर्शित करता है, भले ही फेज शिफ्ट डिटेक्शन लिमिट दोनों मामलों में समान हो।

    चरण कंट्रास्ट और डीआईसी माइक्रोस्कोपी के लक्षण
    विशेषता फेस कोणट्रास्ट डीआईसी
    छवि चमक
    (ब्राइटफील्ड = 100 प्रतिशत)
    1.3 प्रतिशत 0.36 - 2.3 प्रतिशत
    एपी-प्रतिदीप्ति प्रकाश हानि
    (ब्राइटफील्ड = 0 प्रतिशत)
    28 प्रतिशत 73 प्रतिशत
    पार्श्व संकल्प कंडेनसर
    वलय
    प्रतिबंधित
    बेहतर
    अक्षीय संकल्प
    (गहराई भेदभाव)
    गरीब बेहतर
    रोशन एपर्चर 10 प्रतिशत
    उद्देश्य NA
    चर
    चरण में बदलाव
    पहचान सीमा
    &एलटी एल /100 &एलटी एल /100
    हाई फेज शिफ्ट में उपयोगिता उपयोगी नहीं उपयोगी
    अज़ीमुथल प्रभाव नहीं हां
    हेलोस और शेड-ऑफ हां नहीं
    सना हुआ नमूना उपयोगी नहीं उपयोगी
    द्विअर्थी नमूने उपयोगी उपयोगी नहीं
    द्विअर्थी नमूना
    कंटेनरों
    हां नहीं
    ब्राइटफ़ील्ड छवि
    बिगड़ना
    थोड़ा कोई नहीं
    लागत उदारवादी उच्च
    तालिका एक

    बड़े ऑप्टिकल पथ अंतर वाले मोटे चरण के नमूनों को ऑप्टिकल सेक्शनिंग तकनीकों का उपयोग करके अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट में आसानी से चित्रित किया जा सकता है, लेकिन प्रभामंडल कलाकृतियों के कारण चरण विपरीत के साथ छवि बनाना अक्सर मुश्किल होता है। अन्य कारक, जैसे कि अज़ीमुथल प्रभाव और डीआईसी में सना हुआ नमूनों की छवि बनाने की क्षमता, दो तकनीकों को ऑफसेट करने में मदद करती है। ऊतक संवर्धन प्रयोगशालाओं में नियमित अवलोकन के लिए चरण विपरीत कहीं अधिक उपयोगी है, जहां प्लास्टिक संस्कृति वाहिकाओं में जीवित कोशिकाओं की इमेजिंग एक दैनिक गतिविधि है। वैकल्पिक रूप से, लाइव सेल इमेजिंग के लिए अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट विधियों (अक्सर टाइम-लैप्स वीडियो के साथ युग्मित) का उपयोग करके उच्च रिज़ॉल्यूशन की जानकारी सबसे अच्छी तरह से प्राप्त की जाती है।सामान्य तौर पर, डीआईसी को जटिल संरेखण प्रक्रिया, नमूना फोकस के निरंतर हेरफेर, एपर्चर आईरिस डायाफ्राम समायोजन, नमूना अभिविन्यास, और इष्टतम विपरीत प्राप्त करने के लिए उद्देश्य नोमार्स्की प्रिज्म के पार्श्व विस्थापन सहित कॉन्फ़िगर और संचालित करने के लिए अधिक तकनीकी कौशल की आवश्यकता होती है। चरण विपरीत सूक्ष्मदर्शी को संरेखित और संचालित करना कहीं अधिक आसान है, और अपेक्षाकृत अनुभवहीन सूक्ष्मदर्शी द्वारा काफी प्रभावी ढंग से उपयोग किया जा सकता है।

    चरण कंट्रास्ट आम तौर पर खराब कंट्रास्ट वाले पारदर्शी चरण नमूनों की इमेजिंग के लिए उपयोगिता में सीमित है। इसके विपरीत, डीआईसी माइक्रोस्कोपी को दाग और बिना दाग वाले दोनों नमूनों के लिए नियोजित किया जा सकता है, लेकिन जब द्विअर्थी सुविधाओं का सामना करना पड़ता है तो कलाकृतियों से ग्रस्त होता है। नमूना कंट्रास्ट पर अधिक नियंत्रण डीआईसी में ऑब्जेक्टिव प्रिज्म (या डी S narmont कम्पेसाटर) का अनुवाद करके किया जाता है, जिसे ग्रेस्केल इंटरफेरेंस रंगों के विभिन्न स्तरों को प्राप्त करने के लिए स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर समायोजित किया जा सकता है, या बहु-रंगीन ऑप्टिकल धुंधला प्रभाव बड़े पथ अंतर। इसके अलावा, नमूना विपरीत और संकल्प को बदलने के लिए कंडेनसर एपर्चर डायाफ्राम को डीआईसी में भी समायोजित किया जा सकता है। चरण कंट्रास्ट कंडेनसर कुंडलाकार डायाफ्राम और उद्देश्य में रखे गए उद्देश्य चरण प्लेट द्वारा वहन किए गए कंट्रास्ट तक सीमित है। वस्तुतः फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के साथ कंट्रास्ट (फेज प्लेट्स के आदान-प्रदान के अलावा) का कोई समायोजन संभव नहीं है।

    कई प्रयोगशालाओं में सबसे महत्वपूर्ण विचारों में, डीआईसी और चरण विपरीत की तुलना करते समय, सहायक घटकों की लागत होती है। चूंकि डीआईसी को कई महंगे बायरफ्रिंजेंट नोमार्स्की प्रिज्म और स्ट्रेन-फ्री ऑप्टिकल एलिमेंट्स (उद्देश्य और कंडेनसर) की आवश्यकता होती है, इसलिए चरण विपरीत घटकों की तुलना में इंस्ट्रूमेंटेशन काफी अधिक महंगा है। कई मामलों में, खासकर जब फोटोमिकोग्राफी और/या डिजिटल इमेजिंग प्राथमिक विचार नहीं है, चरण विपरीत अक्सर प्रयोगशाला के उद्देश्यों की पूर्ति करेगा। हालांकि, जब उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को जीवित कोशिकाओं और ऊतकों, या इसी तरह के नाजुक पारदर्शी चरण नमूनों से प्राप्त किया जाना चाहिए, तो अंतर हस्तक्षेप विपरीत पसंद की तकनीक है।

    सामान्य तौर पर, चरण विपरीत और अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी को पूरक (प्रतिस्पर्धा के बजाय) तकनीकों के रूप में माना जाना चाहिए, और नमूना ऑप्टिकल गुणों, गतिशीलता और आकारिकी की पूरी तरह से जांच करने के लिए एक साथ नियोजित किया जाना चाहिए। कम तटस्थ घनत्व के चरण प्लेटों वाले आधुनिक चरण विपरीत उद्देश्यों की शुरूआत, सूक्ष्मदर्शी को, कई मामलों में, ब्राइटफील्ड, फ्लोरोसेंस, चरण विपरीत और डीआईसी इमेजिंग के उद्देश्यों के एक सेट का उपयोग करने में सक्षम बनाता है।

    डगलस बी। मर्फी - सेल बायोलॉजी और एनाटॉमी और माइक्रोस्कोप सुविधा विभाग, जॉन्स हॉपकिन्स यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन, 725 एन। वोल्फ स्ट्रीट, 107 डब्ल्यूबीएसबी, बाल्टीमोर, मैरीलैंड 21205।

    जान हिन्स्च - लीका माइक्रोसिस्टम्स, इंक।, 90 बोरोलिन रोड, ऑलेंडेल, न्यू जर्सी, 07401।

    केनेथ आर। स्प्रिंग - वैज्ञानिक सलाहकार, लुस्बी, मैरीलैंड, 20657।

    माइकल डब्ल्यू डेविडसन - नेशनल हाई मैग्नेटिक फील्ड लेबोरेटरी, 1800 ईस्ट पॉल डिराक डॉ।, द फ्लोरिडा स्टेट यूनिवर्सिटी, तल्हासी, फ्लोरिडा, 32310।


    इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

    इलेक्ट्रान सम्प्रेषित दूरदर्शी (अंजीर। 6-1 डी) 0.3 एनएम से नीचे के बिंदुओं को हल कर सकता है, लेकिन व्यावहारिक संकल्प आमतौर पर इलेक्ट्रॉन बीम से नमूनों को नुकसान और नमूने तैयार करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों से सीमित होता है। ऐतिहासिक रूप से, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली सबसे आम विधि रसायनों के साथ नमूने को ठीक करना, इसे प्लास्टिक में एम्बेड करना, नमूने को काटना था। पतले खंड, और भारी धातुओं के साथ वर्गों को दाग दें (चित्र 6-4 एफ)। इस तकनीक के साथ, संकल्प लगभग 3 एनएम तक सीमित है, लेकिन यह प्रकाश माइक्रोस्कोपी और आणविक संरचनाओं के बीच की खाई को पाटने के लिए पर्याप्त है। कोशिका जीव विज्ञान में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के उदय के दौरान, 1950 और 1970 के बीच, पतले वर्गों ने कोशिकाओं में ऑर्गेनेल के संगठन के बारे में जो कुछ भी जाना जाता है, उसका सबसे अधिक खुलासा किया।

    (ए, जेएल बोमन के सौजन्य से, कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, डेविस। सी, जे। सिनार्ड के सौजन्य से, येल विश्वविद्यालय, न्यू हेवन, कनेक्टिकट। ई, जॉन ह्यूसर के सौजन्य से, वाशिंगटन विश्वविद्यालय, सेंट लुइस, मिसौरी। डी-एफ, डॉन डब्ल्यू फॉसेट, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल, बोस्टन, मैसाचुसेट्स के सौजन्य से।)

    उच्चतम रिज़ॉल्यूशन नियमित नमूनों के साथ प्राप्त किया जाता है, जैसे कि दो-आयामी प्रोटीन क्रिस्टल तेजी से जमे हुए और देखे जाते हैं, जबकि कांच की एक पतली फिल्म (यानी, अनाकार, गैर-क्रिस्टलीय) बर्फ में एम्बेडेड होते हैं (चित्र 5-11 ए देखें)। यह कहा जाता है क्रायोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी क्योंकि जमे हुए नमूने को रखने वाले चरण को तरल नाइट्रोजन तापमान तक ठंडा किया जाता है। जमे हुए क्रिस्टल के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ और इलेक्ट्रॉन विवर्तन ने बैक्टीरियरहोडॉप्सिन (चित्र 7-8 देखें), एक्वापोरिन जल चैनल (चित्र। 10-15 देखें), और ट्यूबुलिन (चित्र। 34-4) की संरचनाएं 3 से 4 के संकल्प पर निर्मित की हैं। एनएम इन नियमित नमूनों में प्रोटीन की त्रि-आयामी संरचना की गणना के लिए कम्प्यूटेशनल इमेज प्रोसेसिंग विधियों का उपयोग किया जाता है। ये विधियां एक्स-रे विवर्तन पैटर्न से इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्रों की गणना करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों के समान हैं (चित्र 3-10 देखें)। यद्यपि संकल्प सीमित है और इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी में डेटा संग्रह थकाऊ है, इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म छवियों में चरण की जानकारी रखने का लाभ होता है जिसे एक्स-रे विवर्तन के साथ पता लगाना अक्सर मुश्किल होता है।

    इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कम-से-परमाणु संकल्प पर प्रोटीन पॉलिमर और अन्य बड़े मैक्रोमोलेक्यूलर नमूनों का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान है। नमूने तैयार करने और कंट्रास्ट प्रदान करने के लिए विविध विधियों का उपयोग किया जाता है। एक तरीका यह है कि फिलामेंट्स या मैक्रोमोलेक्यूलर असेंबलियों को कांच के बर्फ में फ्रीज किया जाए, जैसा कि पहले बताया गया है (अंजीर देखें। 34-7 और 36-4A)। एक दूसरा नकारात्मक धुंधलापन है, जिससे नमूनों को भारी धातु के लवण के जलीय घोल से सुखाया जाता है (चित्र 6-4 बी)। घने दाग का एक खोल कार्बन की एक पतली फिल्म की सतह पर कणों को घेरता है और लगभग 1 एनएम के संकल्प पर संरचनात्मक विवरण को संरक्षित कर सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक चिकनी सतह पर सुखाए गए मैक्रोमोलेक्यूल्स को इलेक्ट्रोड से वाष्पित धातु के पतले कोट के साथ छायांकित किया जा सकता है (चित्र 6-4 सी)। इस दृष्टिकोण का एक रूपांतर है जो संरक्षण में सुधार करता है, नमूनों को तेजी से फ्रीज करना, अणुओं के आसपास की बर्फ को वाष्पित करना और फिर प्लेटिनम का एक कोट लागू करना (अंजीर देखें। 30-4 और 34-11)।

    कुछ प्रकार की संरचनाओं के माइक्रोग्राफ के कंप्यूटर इमेज प्रोसेसिंग से आणविक संरचना का औसत त्रि-आयामी पुनर्निर्माण प्राप्त हो सकता है। पेचदार समरूपता वाले कणों, जैसे कि एक्टिन फिलामेंट्स (चित्र 33-7) और सूक्ष्मनलिकाएं (चित्र। 34-5 देखें) का विश्लेषण एक छवि-प्रसंस्करण विधि द्वारा किया जाता है जिसे त्रि-आयामी संरचना के पुनर्निर्माण के लिए डीकोनवोल्यूशन कहा जाता है। अलग-अलग विचारों के अनुरूप श्रेणियों में हजारों यादृच्छिक रूप से उन्मुख कणों की छवियों को पहले वर्गीकृत करके एकल कणों का पुनर्निर्माण भी किया जा सकता है। फिर, इस पहनावा से एक औसत त्रि-आयामी संरचना की गणना कम्प्यूटेशनल रूप से की जाती है। एक उदाहरण एक राइबोसोम से जुड़ा Sec61p ट्रांसलोकन है (चित्र 20-6 देखें)। हाल ही में, कंप्यूटिंग प्रगति ने इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप टोमोग्राफी के विकास को जन्म दिया है, जिसमें कई चित्र विभिन्न कोणों से अपेक्षाकृत मोटे नमूने (माइक्रोस्कोप के अंदर विशिष्ट-पुरुषों को झुकाकर) लिए जाते हैं। सुपरइम्पोज़िशन प्रत्येक चित्र को धुंधला कर देता है, लेकिन जब उन्हें त्रि-आयामी मानचित्र में एक साथ मिला दिया जाता है, तो कुछ नैनोमीटर के रिज़ॉल्यूशन पर संपूर्ण कोशिकाओं के रूप में जटिल संरचनाओं की कल्पना की जा सकती है।

    स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) का उपयोग मोटे नमूनों पर किया जा सकता है, जैसे कि संपूर्ण कोशिकाएं या ऊतक जिन्हें एक पतली धातु की फिल्म के साथ तय, सुखाया और लेपित किया गया है। यहां, एक इलेक्ट्रॉन बीम नमूनों की सतह पर एक रेखापुंज पैटर्न को स्कैन करता है, और प्रत्येक बिंदु पर सतह से उत्सर्जित माध्यमिक इलेक्ट्रॉनों को एकत्र किया जाता है और एक छवि (छवि 6-4 ए) के पुनर्निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है। कोशिकाओं की सतह की विशेषताओं और ऊतकों में उनके त्रि-आयामी संबंधों का अध्ययन करने के लिए पारंपरिक एसईएम का संकल्प सीमित है, लेकिन फिर भी मूल्यवान है। इलेक्ट्रॉन बीम का उत्पादन करने के लिए विशेष उच्च-ऊर्जा (क्षेत्र उत्सर्जन) बंदूकों का उपयोग करने वाले एसईएम ने संकल्प में बहुत सुधार किया है, और ये सेलुलर सबस्ट्रक्चर, जैसे कि परमाणु छिद्र (चित्र 14-6 बी देखें) के अध्ययन के लिए बहुत उपयोगी हैं।


    जैविक अनुसंधान में फेज-कंट्रास्ट और डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोपी का कितना उपयोग किया जाता है? - जीव विज्ञान

    लेख सारांश:

    माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयार करना

    माइक्रोस्कोप ऐसे उपकरण हैं जो हमें सूक्ष्म वस्तुओं जैसे सूक्ष्मजीव, बैक्टीरिया, वायरस, कवक और प्रोटोजोआ का अवलोकन करने में सक्षम बनाते हैं। इनका उपयोग पौधे और जंतु ऊतकों के कोशिकीय संगठन, कोशिका विभाजन या समसूत्रण-अर्धसूत्रीविभाजन प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए किया जाता है। रक्त में परजीवी की उपस्थिति, सफेद और लाल रक्त कोशिकाओं की रूपात्मक विशेषताओं जैसे रोग संबंधी मापदंडों का पता लगाने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है। फोरेंसिक और निदान में सूक्ष्म विश्लेषण का महत्व सर्वविदित है। इन जैविक अनुप्रयोगों के अलावा, सूक्ष्मदर्शी की नैनो प्रौद्योगिकी, भौतिकी, रसायन विज्ञान, पर्यावरण और धातु विज्ञान जैसे विज्ञानों में संभावित उपयोगिता है। सूक्ष्मदर्शी की आवर्धन शक्ति या तो प्रकाश या इलेक्ट्रॉनों से प्राप्त होती है। आवर्धन के स्रोत के आधार पर, 2 प्रकार के सूक्ष्मदर्शी: प्रकाश (ऑप्टिकल) और इलेक्ट्रॉन, सूक्ष्म जीवविज्ञानी द्वारा उपयोग किए जाते हैं। मृत और जीवित कोशिकाओं दोनों को देखा जा सकता है लेकिन माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन के लिए विशिष्ट सूक्ष्म तकनीकों द्वारा तैयार करने की आवश्यकता होती है। आइए माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयार करने की तकनीकों के विभिन्न प्रकारों और संशोधनों को देखें।

    1. प्रकाश माइक्रोस्कोपी तैयारी
    :
    विभिन्न प्रकार के प्रकाशीय सूक्ष्मदर्शी जैसे ब्राइट फील्ड, डार्क फील्ड, फेज कंट्रास्ट और फ्लोरोसेंस विभिन्न उद्देश्यों के लिए कार्यरत हैं। माइक्रोस्कोप के प्रकार और अनुप्रयोग के आधार पर अवलोकन के लिए नमूना या वस्तु तैयार की जाती है।

    उज्ज्वल क्षेत्र सूक्ष्मदर्शी- इस प्रकार में, सूक्ष्म क्षेत्र गहरे रंग के नमूने की तुलना में चमकीला दिखाई देता है। नमूना प्रकाश को अवशोषित करता है और अंधेरा दिखाई देता है। यह माइक्रोबियल कोशिकाओं विशेषकर बैक्टीरिया के अवलोकन के लिए आवश्यक है क्योंकि वे अधिक प्रकाश को अवशोषित नहीं करते हैं। सूक्ष्म जीवों की प्रकाश अवशोषण क्षमता में वृद्धि उन्हें उपयुक्त रंगों से रंगने से संभव होती है। स्टेनिंग में तीन प्रकार के डाई, एसिडिक (ईओसिन, एसिड फुकसिन), बेसिक (क्रिस्टल वायलेट, मेथिलीन ब्लू) और न्यूट्रल (संयुक्त एसिडिक और बेसिक डाई) का उपयोग किया जाता है। डाई लगाने के बाद मॉर्डेंट सॉल्यूशन (आयोडीन, टैनिक एसिड) से उपचार किया जाता है जो डाई के साथ अघुलनशील कॉम्प्लेक्स बनाता है और इसे सेल मेम्ब्रेन या सेल वॉल में जमा करता है। डाई या पानी से धोने से रोकने के लिए नमूना स्मीयर गर्मी या फॉर्मेलिन समाधान द्वारा तय किए जाते हैं। सना हुआ स्मीयर भी कनाडा के बाल्सम समाधान के साथ इलाज करके स्थायी रूप से संरक्षित किया जा सकता है। विसर्जन तेल का उपयोग संकल्प शक्ति बढ़ाने और वस्तुनिष्ठ लेंस की कार्य दूरी को कम करने के लिए भी किया जाता है। सना हुआ तैयारी आवश्यक है क्योंकि जीवित जीवाणु अधिक संरचनात्मक विवरण प्रकट नहीं करते हैं। धुंधलापन का एकमात्र दोष यह है कि नमूने जीवित अवस्था में नहीं देखे जा सकते हैं। कोशिकाओं को धुंधला करना भी अवलोकन के लिए आवश्यक अधिक विपरीत और रंग भेदभाव प्रदान करता है। सूक्ष्मजीवों के लिए विभिन्न प्रकार के दाग और धुंधलापन प्रक्रियाएं उपलब्ध हैं। बाहरी रूपात्मक विशेषताओं जैसे आकार, कोशिका व्यवस्था, कोशिका भित्ति, कशाभिका, पिली, कैप्सूल और आंतरिक संरचनाओं जैसे एंडोस्पोर, साइटोप्लाज्मिक ग्रैन्यूल और माइक्रोबियल सेल के नाभिक को प्रदर्शित करने के लिए विशेष धुंधला तकनीकों को नियोजित किया जाता है। रंग या धुंधलापन में धुंध को सुखाने और ठीक करने जैसे कदम शामिल हैं, जिसके बाद डाई या डाई मिश्रण, मॉर्डेंट, डीकोलाइज़र और काउंटर स्टेन के साथ अनुक्रमिक उपचार किया जाता है। मेथिलीन ब्लू जैसे साधारण दाग सीधे कोशिका को अपना रंग प्रदान करते हैं। बैक्टीरिया आमतौर पर मूल रंगों से रंगे होते हैं क्योंकि उनमें अम्लीय साइटोप्लाज्म होता है। कुछ जीवाणु लक्षण जैसे कि कैप्सूल डाई नहीं लेते हैं, इसलिए वे नकारात्मक रूप से दागदार होते हैं। इसके लिए, बैक्टीरियल सस्पेंशन को डाई निग्रोसिन या इंडिया इंक के साथ मिलाया जाता है, स्मियर किया जाता है और सुखाया जाता है। माइक्रोस्कोप के तहत, कोशिकाएं गहरे रंग की पृष्ठभूमि के खिलाफ बिना दाग वाले चमकीले शरीर के रूप में दिखाई देती हैं। कुछ बैक्टीरिया (स्पाइरोकेट्स) साधारण दागों से दागदार नहीं होते हैं, नकारात्मक धुंधलापन द्वारा देखे जा सकते हैं। फ्लैगेला जैसी बहुत नाजुक संरचनाएं डाई संसेचन द्वारा दागी जाती हैं। चूंकि वे बहुत पतले होते हैं, उन्हें डाई के घोल से उपचारित किया जाता है ताकि संरचना पर डाई का जमाव हो सके। यह धुंधला हो जाता है और साथ ही उस संरचना की मोटाई में वृद्धि करता है। ग्राम प्रतिक्रिया और एसिड फास्ट स्टेनिंग जैसी विभेदक धुंधला प्रक्रियाएं विभिन्न बैक्टीरिया या उनके संरचनात्मक घटकों को अलग-अलग रंग प्रदान करती हैं। ग्राम दाग बैक्टीरिया को 2 व्यापक समूहों में अलग करता है: ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नेगेटिव कोशिका भित्ति संरचना में उनके अंतर के आधार पर। जीवाणुओं की पहचान और वर्गीकरण में ग्राम स्टेनिंग बहुत आवश्यक तकनीक है। यह जीवाणुओं की धुंधलापन विधि का भी एक आदर्श उदाहरण है और इसलिए इस लेख में वर्णन करना अनिवार्य लगा। इसका आविष्कार वैज्ञानिक क्रिश्चियन ग्राम ने 1884 में किया था। इसमें 4 चरण शामिल हैं: पहला कदम क्रिस्टल वायलेट समाधान के साथ स्मीयर का प्राथमिक धुंधलापन है। दूसरे चरण में, कोशिका की दीवार में प्राथमिक दाग को ठीक करने के लिए आयोडीन के घोल को मॉर्डेंट के रूप में लगाया जाता है। प्राथमिक दाग को अल्कोहल या एसीटोन से रंगा जाता है। चौथा चरण तटस्थ लाल या सेफ़्रैनिन द्वारा काउंटर स्टेनिंग है। प्रत्येक चरण को निश्चित समय के साथ किया जाता है और उसके बाद आसुत जल में रुक-रुक कर धुलाई की जाती है। ग्राम नेगेटिव बैक्टीरिया काउंटर स्टेन का रंग लेते हैं जबकि ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया क्रिस्टल वायलेट के बैंगनी रंग को बरकरार रखते हैं। इसी तरह बैक्टीरिया, यीस्ट, कवक, एक्टिनोमाइसेट्स, शैवाल, प्रोटोजोआ और बैक्टीरिया के विशेष समूह जैसे रिकेट्सिया को सूक्ष्म अध्ययन के लिए दाग दिया जाता है।

    डार्क फील्ड माइक्रोस्कोप- इस माइक्रोस्कोपी में, नमूना अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ उज्ज्वल दिखाई देता है और यह माइक्रोस्कोप के कंडेनसर द्वारा प्राप्त किया जाता है। डार्क फील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग बिना दाग वाले नमूनों के अवलोकन के लिए किया जाता है। उनके रहने की स्थिति में नमूना देखा जा सकता है। इसके लिए वेट माउंट और हैंगिंग ड्रॉप की तैयारी की जाती है। माइक्रोबियल सेल सस्पेंशन को ग्रीस फ्री कैविटी स्लाइड पर (ड्रॉप के रूप में और स्मीयर नहीं) रखा जाता है। सस्पेंशन ड्रॉप के वाष्पीकरण से बचने के लिए कवरस्लिप को मोम के साथ रखा और सील किया जाता है। हालांकि, रूपात्मक लक्षण प्रकट नहीं होते हैं, लेकिन व्यक्तिगत कोशिका गति जैसे गतिशीलता को देखा जा सकता है।

    फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप- इसका उपयोग बिना दाग वाली कोशिकाओं और उनके साइटोलॉजिकल अंतरों का निरीक्षण करने के लिए किया जाता है। इसका कार्य सिद्धांत पर आधारित है कि रोशनी द्वारा परिवर्तित चरण संबंध साइटोप्लाज्म में अन्यथा अदृश्य तत्वों द्वारा प्रेरित होते हैं। माइक्रोस्कोप चरण विपरीत उद्देश्य और विशेष कंडेनसर के साथ प्रदान किया जाता है। यह सेल के भीतर बिना दाग वाली संरचनाओं को अलग करने में सक्षम बनाता है जो उनके अपवर्तक सूचकांकों में केवल थोड़ा भिन्न होते हैं। चूंकि किसी धुंधलापन की आवश्यकता नहीं होती है, रासायनिक और रूपात्मक परिवर्तन जीवित नहीं होते हैं या स्थिर माइक्रोबियल कोशिकाओं को देखा जा सकता है।

    प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी- फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का कार्य फ्लोरोसेंस की घटना पर आधारित है। जब कोई डाई कुछ तरंग दैर्ध्य के प्रकाश को अवशोषित करती है, तो कम ऊर्जा और लंबी तरंग दैर्ध्य का प्रकाश भी उत्सर्जित करती है। व्यवहार में, रोगाणुओं को फ़्लोरेसिन या रोडामाइन जैसे फ्लोरोसेंट रंगों से दाग दिया जाता है। नियमित रूप से नियोजित धुंधला फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी तकनीक (FAT) है, जिसे प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस विधि के रूप में भी जाना जाता है। इसमें, फ्लोरोसेंट डाई को माइक्रोबियल सेल एंटीबॉडी के साथ जोड़ा जाता है, ऐसे लेबल वाले एंटीबॉडी को माइक्रोबियल सस्पेंशन के साथ मिलाया जाता है और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत देखा जाता है। एफएटी माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस, विब्रियो हैजा, निसेरिया मेनिंगिटिडिस, कैंडिडा अल्बिकन्स, फेकल कोलीफॉर्म और स्ट्रेप्टोकोकी, स्यूडोमोनैड्स, पोलियो और रेबीज वायरस जैसे रोगजनकों की पहचान के लिए डायग्नोस्टिक पैथोलॉजी में बहुत मददगार रहा है।

    2. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तैयारी: इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म तकनीक प्रकाश माइक्रोस्कोपी से काफी भिन्न होती हैं। वे चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में अत्यंत संकीर्ण तरंग दैर्ध्य इलेक्ट्रॉन बीम का उपयोग करके उच्च रिज़ॉल्यूशन और आवर्धन देते हैं। ट्रांसमिशन और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में परिवर्तनशील अनुप्रयोग और नमूना तैयार करने की तकनीक है। उनमें से कुछ का वर्णन यहाँ किया गया है।

    स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप- नमूना इलेक्ट्रॉन बीम द्वारा सतह स्कैनिंग के अधीन है। आकार और रासायनिक संरचना के आधार पर, विकिरणित नमूना द्वितीयक इलेक्ट्रॉनों का उत्सर्जन करता है। यह सतह की स्थलाकृति और नमूने की 3-डी संरचना को प्रकट करता है।

    ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) - टीईएम द्वारा देखे जाने के लिए नमूने अल्ट्राथिन होने चाहिए। यहां तक ​​कि जीवाणु कोशिकाएं भी इंट्रासेल्युलर विवरण देखने के लिए बहुत मोटी होती हैं। अल्ट्राथिन सेक्शनिंग विशेष तकनीक द्वारा की जाती है। बैक्टीरियल कोशिकाओं को प्लास्टिक ब्लॉक में एम्बेडेड किया जाता है और अल्ट्राथिन स्लाइस (60 एनएम) में काटा जाता है। फिर अनुभागों को यूरेनियम या लैंथेनियम लवण द्वारा दाग दिया जाता है। चूंकि कोशिकाओं को विभिन्न कोणों पर काटा जाता है, इसलिए संरचनात्मक संगठन के बारे में हर विवरण प्राप्त किया जाता है। स्थिर अल्ट्राथिन वर्गों को फ्रीज फ्रैक्चरिंग द्वारा देखा जा सकता है। यहां नमूना दागदार नहीं है, लेकिन बाह्य विवरणों को प्रकट करने के लिए कार्बन प्रतिकृतियां तैयार की जाती हैं। एक अन्य तकनीक में, नमूने को विशेष तांबे के ग्रिड पर सुखाया जाता है और निर्वात में रखा जाता है। भारी धातु प्लेटिनम के परमाणुओं को नमूने पर अत्यधिक गर्म कोण वाले फिलामेंट से प्रक्षेपित और जमा किया जाता है। इसे छाया कास्टिंग कहा जाता है। छायांकित छवि के टीईएम अवलोकन से नमूने के आकार के बारे में विवरण का पता चलता है। प्रकाश माइक्रोस्कोपी के समान नकारात्मक धुंधलापन लेकिन इलेक्ट्रॉन घने फॉस्फोटुंगस्टिक एसिड का उपयोग दाग के रूप में किया जाता है। इसका उपयोग वायरस, फ्लैगेला और पिली के बारीक विवरण देखने के लिए किया जाता है।


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